本发明专利技术公开了一种产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因工程菌，其在出发菌株基因组中敲除了编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；插入了编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；且所述出发菌株为保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC。本发明专利技术还公开了所述基因工程菌的制备方法和应用。本发明专利技术所述基因工程菌L‑异亮氨酸的产量增加了5％，代谢支路的副产物赖氨酸的合成减弱了45.24％，降低了生产成本，具有广阔的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体地涉及一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
L-异亮氨酸(L-isoleucine，ILE)，化学名为“β-甲基-α-氨基戊酸”，分子式：C6H13NO2，相对分子质量：131.17，是八种必需的氨基酸之一，同时又与L-缬氨酸和L-亮氨酸统称为“分支链氨基酸”(BCAAs)。L-异亮氨酸是人体激素、蛋白质合成和能量生成的原料，能够促进蛋白质合成并抑制其分解，在磷脂双层膜蛋白的跨膜结构域相互作用中也发挥至关重要的作用。因此，L-异亮氨酸被广泛应用于食品和医药等行业，具有巨大的商业价值。传统的L-异亮氨酸生产方法主要有提取法、化学合成法和微生物发酵法。提取法是水解蛋白质从混合氨基酸中分离纯化L-异亮氨酸，由于原料来源有限、提取过程中产生大量废水，目前工业生产中已不采用提取法生产L-异亮氨酸。化学合成法是利用丙二酸二乙酯、异戊酸等合成异亮氨酸，但此方法得到的是四种旋光异构体，消旋拆分反应过程复杂，导致生产成本昂贵，限制了该方法的工业应用。目前，工业生产异亮氨酸主要是发酵法，利用微生物的代谢作用可生物合成并过量积累L-异亮氨酸，具有原料成本低、易于控制等优点。国际上，日本发酵法生产L-异亮氨酸占有垄断地位，主要厂家有味之素、协和发酵和田边制药等，大罐菌株产酸能力达30～35g/L，糖酸转化率为20-25％，并可达60-70％的提取率，合计年产量400-500吨。国内厂家主要有梅花集团、阜丰集团、无锡晶海氨基酸公司等，产酸水平及产品质量离日本企业还有一定距离。发酵法的技术核心在于菌种的产酸能力，目前，国内外也有较多关于改造L-异亮氨酸生产菌株的研究。CN107058323A公开了一种基于ilv衰减子的工程菌及其在生产L-异亮氨酸中的应用，该工程菌的摇瓶发酵产酸水平最高达2.55±0.35％。专利技术CN104357503A公开了一种提高L-异亮氨酸产量的方法，通过紫外诱变育种选育出一株甲硫氨酸与赖氨酸双重缺陷型的L-异亮氨酸产生菌，通过5L发酵罐发酵，产酸达到38.9g/L。CN104480057A公开了一株产L-异亮氨酸基因工程菌及其构建方法及应用，该专利技术构建了基因alr的敲除载体，电转到宿主菌中，得到alr的缺陷菌株IWJ001Δalr。利用PCR扩增基因fusA，frr，ilvBN，ilvA，ppnk，将基因片段连接到过表达载体，然后电转入谷氨酸棒杆菌IWJ001Δalr中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌：产L-异亮氨酸基因工程菌IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk。其在3L发酵罐中产异亮氨酸含量为28.6g/L。CN105176907A公开了一种L-异亮氨酸生产菌，以L-苏氨酸基因工程菌CCTCCM2015556作为原始菌株，导入包含大肠杆菌MG1655基因簇ilvGMEDA的重组质粒，获得L-异亮氨酸生产菌，该菌株发酵L-异亮氨酸产量可高达16.31g/L，糖酸转化率达40.78％。CN106701648A公开了一株高产L异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该菌是将谷氨酸棒杆菌CorynebacteriumglutamicumH5菌株敲除了编码精氨基玻咱酸合成酶的argG基因及编码氨基转移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位点插入了编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因的操纵子，所述谷氨酸棒杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016609，产酸水平达到4.8％，即48g/L。以上技术的菌株均存在产酸水平较低的缺点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术中L-异亮氨酸生产菌株产L-异亮氨酸能力不足的缺陷，提供一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用。本专利技术提供的技术方案如下：本专利技术的技术方案之一为一种产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)基因工程菌，其在出发菌株基因组中敲除了编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示；插入了编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示；且所述出发菌株为保藏号为CCTCCNO:M2016609的C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvC。本专利技术术语中，L-异亮氨酸和异亮氨酸均指L-异亮氨酸。本专利技术的操纵子是启动子、终止子等序列和一系列紧密连锁的结构基因的总称，是转录的功能单位。其中，启动子(promoter)是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列，终止子(terminator)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子中，至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。本专利技术中，所述结构基因为lysC突变基因。所述基因敲除为本领域常规技术手段，其为通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造基因组上某一基因的目的的一种技术。所述外源基因通常具有功能基因起始位点几十至几百个核苷酸序列(即上游序列)甚至更长，以及功能基因终止位点前的几十至几百个核苷酸序列(即下游序列)甚至更长，而缺失了功能基因中游的核苷酸序列，从而使得该功能基因在丧失原有功能的同时，又能确保同源重组的有效进行。为了使ddh基因(如SEQIDNo:2所示)丧失其生理功能，在本专利技术中设计了置换型打靶载体，所述打靶载体中的外源基因包括ddh基因的上游序列ddhL和下游序列ddhR的如SEQIDNo:3所示的核苷酸序列，随后筛选具有SEQIDNo:3所示的核苷酸序列的菌株。由此，在一较佳的具体实施例中，所述敲除为将编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因置换为如SEQIDNo:3所示的核苷酸序列。在一较佳的具体实施例中，所述启动子为来源于出发菌株基因组的pgro启动子，所述终止子为来源于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19的rrnB终止子，所述lysC操纵子的序列如SEQIDNo:4所示。在一更佳的具体实施例中，所述编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子插入在ddh基因敲除的位点上。本专利技术中，基因敲除的位点指的是使用基因功能缺失的序列置换功能基因时，原功能基因所处的位置。在一优选的实施例中，所述插入形成如SEQIDNo:5所示的核苷酸序列，由此制得基因工程菌C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC。如上所述，如SEQIDNo:5所示的核苷酸序列从5’至3’方向包括ddhL-lysC操纵子-ddhR序列；或更具体地，其包括ddhL-pgro-lysC突变基因-rrnB-ddhR序列。本专利技术的技术方案之二为一种如上所述的基因工程菌的制备方法，其包括以下的步骤：(1)在保藏号为CCTCCNO:M2016609的C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvC出发菌株基因组敲除ddh基因，获得C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh菌株；(2)在步骤(1)获本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因工程菌，其特征在于，其在出发菌株基因组中敲除了编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；插入了编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；且所述出发菌株为保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicum H5 ΔargG ΔalaT::ilvC。
【技术特征摘要】
1.一种产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)基因工程菌，其特征在于，其在出发菌株基因组中敲除了编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示；插入了编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示；且所述出发菌株为保藏号为CCTCCNO:M2016609的C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvC。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述敲除为将编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因置换为如SEQIDNo:3所示的核苷酸序列。3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述启动子为来源于出发菌株基因组的pgro启动子，所述终止子为来源于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19的rrnB终止子，所述lysC操纵子的序列如SEQIDNo:4所示。4.如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子插入在ddh基因敲除的位点上；优选地，所述插入形成如SEQIDNo:5所示的核苷酸序列，由此制得基因工程菌C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC。5.一种如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤：(1)在保藏号为CCTCCNO:M2016609的C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvC出发菌株基因组敲除ddh基因，获得C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh菌株；(2)在步骤(1)获得的C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh菌株基因组上插入lysC操纵...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏海霞，朱程军，邢盼盼，王炯，李敬，皮莉，左江，黄治华，鲁凡，
申请(专利权)人：武汉远大弘元股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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