一株重组鸭干扰素-α乳杆菌的构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鸭α干扰素基因的合成及其重组载体的构建。本发明专利技术选择乳杆菌表达载体用于构建重组乳杆菌DuIFN‑α‑pPG612.1/L.393株(保藏编号为CGMCC No.17049)。该重组菌株通过木糖诱导成功表达具有生物活性的DuIFN‑α蛋白。该重组菌株的构建使其表达产品既具有乳杆菌的益生性又可以发挥鸭干扰素的生物学功能，为多种鸭病毒性疾病的治疗和预防提供新药物的目的成为现实同时也为以乳杆菌作为传递系统开发新型的动物干扰素产品奠定了一定的理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一株重组鸭干扰素-α乳杆菌的构建及其应用
本专利技术涉及一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌的构建及其应用，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
当前，养鸭业正向着集约化、规模化和商品化的进程迈进，而鸭群的发病率越来越高，且趋于复杂化，严重影响了鸭养殖业的健康发展。目前，我国预防和控制鸭病毒性疾病主要依靠疫苗免疫，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒毒株变异速度快，从而常导致疫苗免疫失败。鸭alpha干扰素(DuIFN-α)作为一种多功能细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生理功能，其不仅对鸭瘟、鸭病毒性肝炎、番鸭细小病毒病、鸭流感等病毒性疾病有较好的治疗效果，而且能够显著提高疫苗的免疫效力。此外，干扰素相比于抗生素具有无毒副作用、无药物残留和不产生耐药性等优点，因此DuIFN-α产品的研发对鸭病毒性疾病的预防和治疗具有重要的临床意义。乳杆菌(Lactobacillus)是一类能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌的统称。由于LAB具有食品级和益生菌的特点，与其它宿主菌株相比，我们利用乳杆菌杆菌作为表达系统，可以更充分利用它的优点，其优势主要通过以下几个方面来进行体现：(1)从目前来看，乳杆菌对于人和动物的机体并没有致病性存在，是安全食品级菌株，为生产绿色安全的食品提供了保障；(2)在人和动物体内的数量较多，对于机体健康起到有益作用，与其它菌株相比，用乳杆菌作为宿主菌表达外源基因，可以获得较高的蛋白表达量；(3)乳杆菌的菌体本身和其分泌的多种物质对于机体均产生的是益生作用，如果使用乳杆菌作为宿主体，携带外源基因进行蛋白表达，这样就可以将菌体、自身分泌物质和外源蛋白三者结合到一起，发挥更大的作用；(4)乳杆菌可以粘附在机体粘膜上，不容易脱落，因此以乳杆菌为宿主菌，构建的基因工程菌可以在机体粘膜处长时间的定植，从而不断繁殖，进而不间断产生目的蛋白向机体释放；(5)因为乳杆菌进入胃及肠道后，可以耐受胃液中的强酸和小肠上段的胆盐，所以重组乳杆菌可以直接口服，由于这一特点可不用进行这样的繁琐步骤例如将目的蛋白进行体外提纯和后加工的一些过程。利用乳杆菌作为表达系统最大价值在于其安全、没有内毒素，表达的外源蛋白可以直接连同菌体一起服用。而且乳杆菌为机体正常菌群，可以在肠道中存活定植，因此口服基因工程乳杆菌后，表达的目的蛋白就可以源源不断在肠道中生产并起到相应的作用。乳杆菌作为表达系统来表达干扰素，既具有乳杆菌的益生性，又可发挥干扰素的生物学功能，并且直接以活菌制剂的形式进行饲喂，可以简化工业上生产程序，降低了饲养成本，同时也为以乳杆菌为传递系统开发人类及动物干扰素类产品开辟新途径，具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于基因重组DuIFN-α蛋白研发的重要临床意义和社会价值，选择pPG612.1载体为表达载体，以乳杆菌(Lactobacillus)Casei393株菌为宿主菌构建乳杆菌(Lactobacillus)DuIFN-α-pPG612.1/L.393重组菌株并在2％木糖条件下诱导该菌株表达DuIFN-α蛋白。本专利技术的技术方案：1.一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该重组鸭alpha干扰素乳杆菌含有连接有如序列3所述DuIFN-α目的基因的表达载体获得的重组表达载体DuIFN-α-pPG612.1；该重组菌株被命名为乳杆菌(Lactobacillus)DuIFN-α-pPG612.1/L.393菌株，简称重组乳杆菌DuIFN-α株，并已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.17049。2.如权利要求1所述一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于其中序列3为DuIFN-α目的基因核苷酸序列为：3.如权利要求1所述一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该重组菌的表达的外源蛋白为鸭alpha干扰素；该表达产物不经分离纯化，直接制成活菌制剂。4.如权利要求1所述一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该该重组菌是通过以下步骤构建的：(1)以提取的鸭肝脏基因组DNA为模板扩增出DuIFN-α目的基因片段；(2)回收并纯化目的基因片段经测序，测序结果确认该PCR产物确为DuIFN-α目的基因；(3)将经双酶切的pPG612.1表达载体与步骤(2)中的目的基因片段连接获得重组DuIFN-α-pPG612.1表达载体；(4)将重组DuIFN-α-pPG612.1表达载体经电转化转入LactobacillusCasei株(即：ATCC393株)乳杆菌细胞中后涂布含有氯霉素的MRS培养平板，37℃静置培养36h后挑取阳性克隆子经测序确认，获得构建阳性重组乳杆菌菌株，该重组菌株被命名为乳杆菌(Lactobacillus)DuIFN-α-pPG612.1/L.393菌株，简称乳杆菌DuIFN-α株，并已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.17049。本专利技术的有益效果乳杆菌(Lactobacillus，英语名：lacticacidbacteria，LAB)是一类能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌的统称。由于LAB具有食品级和益生菌的特点，与大肠杆菌等表达系统相比，LAB系统的最大价值在于其表达的重组蛋白可以不经分离纯化，直接制成活菌制剂后，通过黏膜途径用于机体而达到治疗目的。将干酪乳杆菌与鸭干扰素二者结合，重组菌株将既具有乳杆菌的益生性，又可发挥干扰素的生物学功能，并且直接以活菌制剂的形式进行饲喂，可以简化生产程序，降低了饲养成本，同时也为以乳杆菌为传递系统开发人类及动物干扰素类产品开辟新途径。附图说明图1DuIFN-α目的基因PCR扩增产物经1％DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果，图中Marker为PlusIIDNAMarker。图2重组DuIFN-α蛋白诱导表达结果，图中M为ThermoScientificPageRulerPrestainedProteinLadder(货号：26617；10-180KD)；1为pPG612.1空载体诱导表达样品；2为DuIFN-α诱导表达样品；3为DuIFN-α未诱导表达样品。本专利技术涉及的生物材料资源信息本专利技术人应用生物技术构建的重组乳杆菌DuIFN-α-pPG612.1/L.393菌株作为生产菌株，并通过2％木糖成功诱导表达具有生物活性的DuIFN-α蛋白。该重组菌株已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.17049；乳杆菌LactobacillusCasei株(ATCC393株，购买自北京北纳创联生物技术研究院)；人羊膜毛细胞(Wish细胞，2013年3月购自上海极威生物科技有限公司，上海市崇明县上海泰和经济发展区长兴镇潘园公路1800号2号楼9703室)；水泡性口炎病毒(VSV病毒，2013年3月购自北京北纳创联生物技术公司)。本专利技术的具体实施方式1.根据NCBI核酸数据库中搜索编码DuIFN-α蛋白的576bp核苷酸序列(GenBan本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该重组鸭alpha干扰素乳杆菌含有连接有如序列1所述DuIFN‑α目的基因的表达载体获得的重组表达载体DuIFN‑α‑pPG612.1；该重组菌株被命名为乳杆菌(Lactobacillus)DuIFN‑α‑pPG612.1/L.393株菌株，简称乳杆菌DuIFN‑α株，并已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.17049。

【技术特征摘要】
1.一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该重组鸭alpha干扰素乳杆菌含有连接有如序列1所述DuIFN-α目的基因的表达载体获得的重组表达载体DuIFN-α-pPG612.1；该重组菌株被命名为乳杆菌(Lactobacillus)DuIFN-α-pPG612.1/L.393株菌株，简称乳杆菌DuIFN-α株，并已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.17049。2.如权利要求1所述一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于其中序列1为DuIFN-α目的基因核苷酸序列为：3.如权利要求1所述一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该重组菌的表达的外源蛋白为鸭alpha干扰素；该表达产物不经分离纯化，直接制成活菌制剂。4.如权利要求1所述一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该该重组菌是通...

【专利技术属性】
技术研发人员：江国托，李凤华，许书珍，
申请(专利权)人：大连三仪动物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21