肝细胞癌的风险评价方法技术

本发明专利技术提供灵敏度和特异性高且迅速、简便的肝细胞癌的风险评价方法。本发明专利技术提供一种评价肝细胞癌的风险的方法。该方法包括如下工序：(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的DNA进行扩增的工序，其中，该DNA包含MGRN1基因的外显子区域的CpG位点，(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序，(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该DNA是否是由肝细胞癌的发病风险高的受验体得到的DNA的工序。

Risk assessment method of HCC

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝细胞癌的风险评价方法
本专利技术涉及利用了甲基化DNA的检测的肝细胞癌的风险评价方法。
技术介绍
肝细胞癌(HCC)是全世界熟知的恶性肿瘤，并且可知其主要的发生要因是肝炎病毒的感染。作为肝细胞癌的发生要因的肝炎病毒主要是乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)。HCC通常在患有与肝炎病毒感染相关的慢性肝炎或肝硬化的患者中发病。而且，该患者中的大部分由于在HCC发病的阶段肝功能已经降低，因此，除非早期诊断为癌症，否则无法期待良好的治疗成果。因此，应优先进行慢性肝炎、肝硬化之类的前癌状态的监测(经过观察)。特别是对于具有高HCC发生风险的患者，即使没有主观症状，也应该进行密切监测而在早期发现HCC并进行治疗。另一方面，对没有HCC发生风险的患者而言，密切监测成为过度的负担。因此，为了对慢性肝炎、肝硬化之类的前癌状态的患者进行适当的管理，HCC发生的风险评价非常重要。DNA甲基化的变化是最普遍被观察到的伴随癌发生的表观遗传改变之一。表明DNA甲基化的变化也参与早期癌症和前癌阶段。报告了在由HCC患者得到的可见慢性肝炎或肝硬化的肝脏组织中，发生了与DNA甲基化转移酶的剪接和/或表达的异常相关的DNA甲基化的变化。此外，根据本专利技术人的研究，到此为止提出了一种方法，该方法通过焦磷酸测序、质谱等来检测肝脏组织的基因组DNA的特定的CpG位点的DNA甲基化水平，将检测出的DNA甲基化水平与用于判别为非癌肝脏组织样品的截止值进行比较，从而评价患者的HCC的风险(专利文献1)。该方法实现了灵敏度和特异性高的HCC风险评价。然而，希望一种能够在确保高度的灵敏度和特异性的同时更高效且低成本地评价HCC的风险的方法。最近，公开了一种通过将用亚硫酸氢盐进行了处理的样品DNA供给到离子交换色谱来检测甲基化DNA的方法(专利文献2)。此外，本专利技术人等提出了一种利用该原理将用亚硫酸氢盐进行了处理的样品DNA供给到离子交换色谱，并基于其保留时间来判定肾细胞癌的预后的方法(专利文献3)。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开公报第2012/102377号专利文献2：国际公开公报第2014/136930号专利文献3：国际公开公报第2015/129916号
技术实现思路
基于使用了焦磷酸测序等的DNA甲基化水平的检测的肝细胞癌(HCC)的风险评价法(例如专利文献1)虽然灵敏度和特异性高，但存在DNA甲基化水平的检测耗费时间、劳力、成本的难点。本专利技术提供具有高灵敏度和特异性的同时简便、迅速且低成本的HCC的风险评价方法。本专利技术人等发现，将由受验体的肝脏组织得到的包含CpG位点的样品DNA用亚硫酸氢盐进行处理，将DNA进行扩增，将该扩增产物用离子交换色谱进行分离，从而能够简便且迅速地检测该CpG位点的DNA甲基化。此外，本专利技术人等发现通过该色谱得到的检测信号的峰形状在HCC高风险组和低风险组中不同。通过该色谱得到的检测信号的峰形状成为HCC的风险评价的指标。进一步令人吃惊的是，本专利技术人等发现在通过上述使用离子交换色谱的CpG位点的DNA甲基化分析进行的HCC的风险评价中，在将特定的CpG位点作为分析对象时，与其它CpG位点相比，能够实现显著高的灵敏度和特异性。因此，通过将该使用离子交换色谱的DNA甲基化分析与作为该特定的CpG位点的样品的利用进行组合，可实现兼具简便性和迅速性以及高度的灵敏度和特异性的HCC的风险评价。因此，本专利技术提供以下方案。〔1〕一种评价肝细胞癌的风险的方法，包括如下工序：(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的DNA进行扩增的工序，其中，该DNA包含MGRN1基因的外显子区域的CpG位点，(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序，(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该DNA是否是由肝细胞癌的发病风险高的受验体得到的DNA的工序。〔2〕一种评价肝细胞癌的风险的方法，包括如下工序：(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的DNA进行扩增的工序，其中，该DNA包含MGRN1基因的外显子区域的CpG位点，(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序，(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该受验体的肝细胞癌的发病风险是否高的工序。〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述DNA包含由序列号1所示的核苷酸序列或者与该序列具有至少95％同源性的核苷酸序列构成的DNA。〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，所述(3)中，所述检测信号的峰的形状为单峰的甲基化DNA的峰时，选择该DNA作为由肝细胞癌的发病风险高的受验体得到的DNA，所述检测信号的峰的形状为双峰性时，选择该DNA作为由肝细胞癌的发病风险低的受验体得到的DNA。〔5〕根据〔4〕所述的方法，其中，所述(3)包括通过将所述检测信号的峰的保留时间与阳性对照或阴性对照的检测信号的峰的保留时间进行比较来确认获得所述甲基化DNA的峰，该阳性对照的检测信号是通过将由与来自所述受验体的肝脏组织的DNA相同的序列构成且100％甲基化的DNA被亚硫酸氢盐处理和扩增时得到的DNA供给到离子交换色谱而得到的，该阴性对照的检测信号是通过将由与来自该受验体的肝脏组织的DNA相同的序列构成且没有甲基化的DNA被亚硫酸氢盐处理和扩增时得到的DNA供给到离子交换色谱而得到的。〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中，所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。根据本专利技术，与以通过焦磷酸测序等而检测的DNA甲基化水平为指标的现有方法(例如专利文献1)相比，能够在维持高度的检测灵敏度和特异性的同时更简便且迅速地评价肝细胞癌的风险。附图说明图1是由来自HCC患者的非癌肝脏组织样品(N组)的Liv25区域得到的色谱图的例子。各图表示来自各个样品的数据，各图中的符号表示样品ID。图2是图1的数据的一次微分值的图表。图3是由健康肝脏组织样品(C组)的Liv25区域得到的色谱图的例子。各图表示来自各个样品的数据，各图中的符号表示样品ID。图4是图3的数据的一次微分值的图表。具体实施方式本说明书中，“肝细胞癌”(Hepatocellularcarcinoma；也称为HCC)是指由肝脏的实质即肝细胞产生的原发性肝癌。本说明书中，“肝细胞癌的风险”是指肝细胞癌的发生风险。本说明书中，“CpG位点”是指DNA序列上胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)之间进行磷酸二酯键合(p)的部位。本说明书中，“DNA甲基化”是指在上述CpG位点中，胞嘧啶的5位的碳被甲基化的状态。本说明书中，DNA的“甲基化水平”是指该DNA的甲基化的比例(也称为甲基化率)。本说明书中，关于核苷酸序列的“至少95％同源性”是指95％以上、优选97％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上、进一步优选99.5％以上的同源性。...

【技术保护点】
1.一种评价肝细胞癌的风险的方法，包括如下工序：/n(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的DNA进行扩增的工序，其中，该DNA包含MGRN1基因的外显子区域的CpG位点，/n(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序，/n(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该DNA是否是由肝细胞癌的发病风险高的受验体得到的DNA的工序。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170823 JP 2017-1602841.一种评价肝细胞癌的风险的方法，包括如下工序：
(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的DNA进行扩增的工序，其中，该DNA包含MGRN1基因的外显子区域的CpG位点，
(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序，
(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该DNA是否是由肝细胞癌的发病风险高的受验体得到的DNA的工序。


2.一种评价肝细胞癌的风险的方法，包括如下工序：
(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的DNA进行扩增的工序，其中，该DNA包含MGRN1基因的外显子区域的CpG位点，
(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序，
(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该受验体的肝细胞癌的发病风险是否高的工序。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述DNA包含由序列号1所示的核苷酸序列或者与该序列具有至少95％同源性的核苷酸序列构成...

【专利技术属性】
技术研发人员：金井弥荣，新井惠吏，与谷卓也，砂村荣一郎，
申请(专利权)人：国立研究开发法人国立癌研究中心，积水医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP