一种大引物PCR定点突变的方法技术

本公开提供了一种大引物PCR定点突变的方法，所述方法的操作步骤为：(1)根据目的基因序列设计引物，得到两个侧翼引物，分别为上侧翼引物和下侧翼引物；(2)根据突变碱基所处序列位置设计突变引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；(3)由突变引物与距突变位点较远的侧翼引物进行第一步PCR反应得到大引物；(4)将得到的大引物中加入两个侧翼引物进行第二步PCR扩增，得到突变目的基因序列。所述方法中在设计突变引物时，是将突变位点设计于突变引物序列的中间位置，这样使得在后续PCR反应中，有利于突变引物与模板的结合，从而提高了突变率。

A method of PCR site directed mutation with large primers

【技术实现步骤摘要】
一种大引物PCR定点突变的方法
本公开涉及基因工程
，具体涉及一种大引物PCR定点突变的方法。
技术介绍
定点诱变(site-directedmutagenesis,SDM)是阐明基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系的不可缺少的研究手段。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是一种用于在生物体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，能将微量的DNA大幅增加。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA经高温(95℃～98℃)加热一定时间后，DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA会解离打开成为单链DNA片段将作为模板；反应温度随即降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列通过碱基配对结合；在DNA模板与引物结合后，TaqDNA聚合酶会结合其上，并以靶序列为模板，以dNTP为底物，按照碱基互补配对和半保留复制的原则，合成一条新的与模板DNA链互补的单链DNA。相对其它基于PCR的定点诱变方法而言，大引物(megaprimer)PCR定点诱变技术因简便实用而广受欢迎。经典的大引物需要2条侧翼引物和1条突变引物进行两轮PCR反应。即以第1轮PCR中产生的含点突变的产物做引物进行第2轮PCR反应，再以所得产物为模板及作为大引物进一步扩增以提高突变基因的得率，一般也需要对原始模板进行酶消化以避免原始基因干扰，第一轮PCR和第二轮PCR之间进行胶回收得到大引物片段。许多国内外学者对其进行了改进和优化，使得整个过程可以在单管中进行并不需要凝胶回收大引物片段。有的学者设计分别缺少正向或反向侧翼引物可结合的互补序列的两个不同质粒作为模板，中间大引物无需纯化，可完全避免了对野生型全长质粒的扩增。有的学者使用抗性不同的模板载体和突变基因载体，防止野生型质粒干扰。但这些改进方法仍受PCR反应条件的影响在产生过长的大引物后突变成功率不高，突变效率不能达到100％。
技术实现思路
本公开的目的是提供一种大引物PCR定点突变的方法，以达到提高突变率的目的。为实现上述目的，技术方案如下：一种大引物PCR定点突变的方法，所述方法的操作步骤为：(1)根据目的基因序列设计引物，得到两个侧翼引物，分别为上侧翼引物和下侧翼引物；(2)根据突变碱基所处序列位置设计突变引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；(3)由突变引物与距突变位点较远的侧翼引物进行第一步PCR反应得到大引物；(4)将得到的大引物中加入两个侧翼引物进行第二步PCR扩增，得到突变目的基因序列。所述侧翼引物的退火温度在50-75℃之间，所述侧翼引物以碱基G或C结尾。所述突变引物的序列以碱基G或C结尾，所述突变引物序列中的GC含量在40％-60％之间。所述第一步PCR的反应条件为：首先是95℃-98℃预变性90s-100s；然后95℃-98℃变性20s-30s，50℃-55℃退火10s-20s，70℃-75℃延伸20s-30s，循环20-22次；最后70℃-75℃延伸4min-6min。所述第二步PCR的反应条件为：首先95℃-98℃预变性90s-100s；然后95℃-98℃变性20s-30s，65℃-68℃退火20s-30s，70℃-75℃延伸20s-30s，循环8-10次；然后95℃-98℃变性20s-30s，50℃-55℃退火20s-30s，70℃-75℃延伸20s-30s，循环20-22次；最后70℃-75℃延伸4min-6min。PCR反应所使用的DNA聚合酶为高保真PrimerSTARHSDNA聚合酶。所述第一步PCR反应的体系是DNA聚合酶预混试剂：突变引物：侧翼引物：目的基因序列模板DNA：无菌水的比例为10：1：1：0.5：7.5。所述第一步PCR反应所使用引物的浓度为4μM。所述第二步PCR反应的体系是DNA聚合酶预混试剂：上侧翼引物：下侧翼引物：大引物：无菌水的比例为25：0.5：0.5：13：11。所述第二步PCR反应所使用引物的浓度为20μM。本公开的有益效果是：提供了一种大引物PCR定点突变的方法，所述方法中在设计突变引物时，是将突变位点设计于突变引物序列的中间位置，这样使得在后续PCR反应中，有利于突变引物与模板的结合，从而提高了突变率。所述方法通过对退火温度与热循环参数进行优化，以及第二轮PCR中的不对称PCR，提高了通过产生700bp至1200bp的大引物的突变效率，突变成功率为100％，所述方法不需要纯化大引物或设计特别的侧翼引物，使用高保真DNA聚合酶可耐受98℃的高温短时变性和缩短退火时间，保证突变点除外的扩增产物中基因序列的正确性和有效节省了时间。附图说明图1为实施例1-4中所产生的第一轮PCR产物和第二轮PCR产物的电泳图。图2为实施例1-4中第二轮PCR产物双酶切电泳图。图3为实施例1-4中测序结果比对图。具体实施方式以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。实施例1通过NCBI数据库搜索下载地衣芽孢杆菌ABC转运蛋白B1MsmE基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，然后根据MsmE基因的核苷酸序列用Snapgene设计其上、下侧翼引物，其中上、下侧翼引物序列分别为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3，然后确定需要突变的位点位于目的基因的前半部分，利用Snapgene设计以突变位点为中心的突变引物1SEQIDNO.4，具体引物序列如表1所示，其中上侧翼引物序列中的gcagctg是保护碱基，上侧翼引物的酶切位点是CATATG；下侧翼引物序列中的cgac是保护碱基，酶切位点是GGATCC；表1中划线部分表示突变后的碱基。表1引物序列根据上述突变引物和下侧翼引物进行第一轮PCR反应，其中PCR反应体系为：10μLDNA聚合酶预混试剂，1μL突变引物1，1μL下侧翼引物，0.5μlMsmE基因序列模板(～30ng/μl)，7.5μL无菌水，其中引物的浓度为4μM，其中DNA聚合酶预混试剂为2×PrimerSTARHS(premix)(Takara生物技术有限公司)。第一轮PCR反应条件：95℃预变性95s；95℃变性20s，50℃退火25s，72℃延伸30s，20次循环；72℃继续延伸5min。第一轮PCR反应后产生大引物，取出7μL的第一轮PCR产物，将剩下的13μL直接在同一管中加入上下侧翼引物、PCR预混试剂盒试剂进行第二轮PCR反应；第二轮PCR反应中直接加入上侧翼引物和下侧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述方法的操作步骤为：/n(1)根据目的基因序列设计引物，得到两个侧翼引物，分别为上侧翼引物和下侧翼引物；/n(2)根据突变碱基所处序列位置设计突变引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；/n(3)由突变引物与距突变位点较远的侧翼引物进行第一步PCR反应得到大引物；/n(4)将得到的大引物中加入两个侧翼引物进行第二步PCR扩增，得到突变目的基因序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述方法的操作步骤为：
(1)根据目的基因序列设计引物，得到两个侧翼引物，分别为上侧翼引物和下侧翼引物；
(2)根据突变碱基所处序列位置设计突变引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；
(3)由突变引物与距突变位点较远的侧翼引物进行第一步PCR反应得到大引物；
(4)将得到的大引物中加入两个侧翼引物进行第二步PCR扩增，得到突变目的基因序列。


2.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述侧翼引物的退火温度在50-75℃之间，所述侧翼引物以碱基G或C结尾。


3.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述突变引物的序列以碱基G或C结尾，所述突变引物序列中的GC含量在40％-60％之间。


4.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述第一步PCR的反应条件为：首先是95℃-98℃预变性90s-100s；然后95℃-98℃变性20s-30s，50℃-55℃退火10s-20s，70℃-75℃延伸20s-30s，循环20-22次；最后70℃-75℃延伸4min-6min。


5.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述第二步PCR的反应条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟先锋，杨思婷，苏思韵，张宇博，黄珍金，吕蕾，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东;44