一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，包括步骤：1)预处理：筛选原料颗粒完整、饱满的固态发酵曲料样品，进行冷冻处理；2)初步研磨：将球状助研磨体加入步骤1)所得固态发酵曲料中，加入液氮并进行研磨，使曲料表面的菌体剥离脱落，同时保持曲料中原料颗粒完整；3)在初步研磨后，将原料颗粒除去，得到菌体混合物；4)充分研磨步骤3)所得菌体混合物，获得含菌体RNA的粉末料；5)向步骤4)所得粉末料中加入总RNA提取剂，提取总RNA，即得。本发明专利技术的方法适用于从曲料等复杂基质中提取丝状真菌的总RNA，该方法提取的丝状真菌总RNA纯度高、完整性好。

A method of extracting total RNA of filamentous fungi from Koji

【技术实现步骤摘要】
一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法
本专利技术涉及RNA提取
，尤其是一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法。
技术介绍
制曲是豆豉、酱油及豆酱发酵生产的必要过程，其中，酱油和豆酱的制曲过程是大豆、小麦等原材料在米曲霉、酱油曲霉等丝状真菌分泌的多种酶作用下被逐步降解的过程，其中米曲霉的使用最为广泛。在这个过程中，米曲霉分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，目前的研究集中于酶活等理化性质鉴定，但是对其深层分子机理和表达调控研究甚少，其中曲料中真菌总RNA的提取技术是分子机理和表达调控研究的基础。现行的常规真菌总RNA提取方法主要包括CTAB法、热酚法、异硫氰酸胍法、Trizol法等，另外还可以使用柱离心法对RNA进行纯化。专利技术专利CN101638651B公布了一种改良Trizol法提取植物组织总RNA的方法，该方法特征在于用常规的Trizol法提取RNA后，加入氯仿/异戊醇再次抽提，并用异丙醇和醋酸钠沉淀RNA。该方法不适用于从曲料这种复杂基质中去除大豆、小麦大颗粒等成分，破碎菌丝细胞壁效率低，因此总RNA提取质量不佳。专利技术专利CN107267497B公布了一种通用型总RNA抽提试剂盒，改良的异硫氰酸胍法适用于植物根、果实等富含多酚、多糖的组织总RNA的提取，但是硅基质柱法无法满足曲料大培养体系抽提RNA的需要。然而，常规的细胞总RNA提取方法不适用于曲料，曲料中总RNA难以提取的主要原因有三点：第一，对于固态发酵曲料而言，菌丝和孢子附着生长在曲料表面，常规提取方法难以实现分离及富集；第二，制曲过程中产生多种次级代谢产物，曲霉包含丰富的内源性RNase，导致提取过程有严重的RNA降解现象；第三，曲料中的丝状真菌的细胞壁结构包含几丁质、葡聚糖等难去除的多糖，RNA提取时能否有效的破壁严重影响RNA的提取质量。曲料中丝状真菌总RNA的提取尚未发展出成熟的技术，导致制曲基础研究的滞后。从实验室水平的液体、固体培养基中提取RNA与从生产工艺水平的固态发酵曲料中提取RNA面临的困难有相似之处，也有很大区别。相同点在于：两者都必须将菌体与培养基质分离才能进行后续操作，其相似来自微生物培养体系的复杂性和现有核酸提取技术的原理限定；不同点在于：实验室培养水平要分离菌体容易实现，从液体培养基中提取RNA可采用过滤法、而从固体培养基中提取RNA可采用直接刮取菌丝或用玻璃纸隔离，甚至改变培养介质和条件都能实现，而实验室培养体系下总RNA的提取方法不能直接套用在固态发酵曲料中真菌总RNA的提取，其原因有三：1、生产工艺是固定的，不能改变制曲过程，只能从制备的成曲曲料着手；2、RNA提取过程会改变RNA转录调控的状态，影响转录组测序的结果，最好的方式是原位处理提取，应避免使用复杂的前处理方法；3、曲霉附着在曲料表面，虽然是好氧菌，但是其菌丝扎根向大豆内部生长，大豆、淀粉、菌体、孢子互相包裹粘黏，导致“去除培养基”成为主要的技术瓶颈。CN101434630B、CN105779442B记载的方法准确描述应为“涡旋振荡+玻璃珠匀浆”。其核心在于利用高频振动破碎细胞，加入玻璃珠增加机械剪切力，如前所述，然而采用此类方法从固态发酵曲料中进行真菌总RNA的提取，不能获得合格的样品。综上所述，现有的总RNA提取方法并不适用于从曲料这种复杂基质中提取RNA。固态发酵制曲的培养基质成分复杂，丝状真菌的菌丝和孢子难以被有效分离和富集，从源头上限制了曲料中丝状真菌总RNA的高质量(纯度高、完整性好)提取，因此，需要一种能有效富集菌丝与孢子方法，但是目前并没有技术能够有效克服该瓶颈。目前国内也没有从曲料中提取丝状真菌的总RNA提取方法的相关专利技术专利报道。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，该方法通过安全、迅速、简单的操作，从含有RNA的固态发酵曲料中选择性的提取高纯度、完整性好的丝状真菌总RNA。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，包括如下步骤：1)预处理：筛选原料颗粒完整、饱满的固态发酵曲料样品，进行冷冻处理；2)初步研磨：将球状助研磨体加入步骤1)所得固态发酵曲料中，加入液氮进行研磨，使曲料表面的菌体剥离脱落，同时保持曲料中原料颗粒完整；其中，原料颗粒为固态发酵的常规原料，例如黄豆颗粒、黑豆颗粒、小麦颗粒等；3)菌丝和孢子富集：在初步研磨后，将所述原料颗粒除去，得到菌体混合物；由此，达到富集菌丝和孢子的目的；除去的方法为常规分离方法，优选为人工挑选除去；4)获得含菌体RNA的粉末料：充分研磨步骤3)所得菌体混合物，获得含菌体RNA的粉末料；5)提取总RNA：向步骤4)所得粉末料中加入总RNA提取剂，提取总RNA，即得。需要说明的是，本申请的专利技术人前期通过直接液氮研磨、冻干、缓冲液洗涤、涡旋振荡、玻璃珠匀浆、液体裂解等方法进行样品前处理，然而得到的RNA质量都低于样品测序要求，或者说公开的RNA提取方法，包括经典核酸提取方法不能直接应用于固态发酵曲料中丝状真菌总RNA的提取，公开的提取方法例如中国授权专利CN100537590-RNA提取方法、RNA提取试剂及生物材料的分析方法中公开了从全血、血清、培养细胞等生物材料中提取总RNA的方法，直接将生物材料进行溶解如采用乳钵、超声波、微波、匀浆器等物理方法，或表面活性剂、蛋白变性剂等化学方法，或蛋白分解酶等生化方法以及上述组合方法进行，未公开如何将生物材料进行有效分离，而本专利申请中采用的物料为固态发酵曲料，固态发酵曲料由发酵大豆颗粒表面包裹着曲料小麦颗粒组成，即曲料小麦颗粒附着在发酵大豆颗粒表皮上，丝状真菌附着生长在固态发酵曲料表面，因为发酵大豆颗粒中含有的多糖、多酚等物质严重影响RNA的提取，并且发酵大豆颗粒的存在，在充分研磨时影响物料的充分破碎裂解。本申请专利技术人通过对比发现，若将冷冻处理过的固态发酵曲料未经发酵大豆颗粒分离步骤，直接研磨获取含丝状真菌RNA物料，所获取的物料颗粒感强，在研磨破碎阶段无法实现物料充分的破碎裂解，最终导致提取的丝状真菌总RNA纯度低、完整性差，不能满足进一步的样品测序分析的需要，发酵大豆颗粒的存在直接影响了RNA的得率和质量，而采用本专利技术方法所获取的含丝状真菌RNA物料细腻，可很好的实现物料破碎裂解，提取的丝状真菌总RNA纯度高、完整性好，满足样品测序分析的需要，因此，曲料中丝状真菌RNA的提取首先需将固态发酵曲料中的发酵大豆颗粒进行分离。优选地，所述步骤1)中曲料为豆豉、酱油或豆酱固态发酵所得曲料。优选地，所述步骤1)中冷冻处理的温度为-75～-86℃，更优选为-80℃。优选地，所述步骤1)中冷冻预处理2h以上。优选地，所述步骤2)中单个球状助研磨体体积不超过单个曲料体积的1/1000。由此，球状助研磨体从曲料缝隙中滑落并平铺至曲料本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)预处理：/n筛选原料颗粒完整、饱满的固态发酵曲料样品，进行冷冻处理；/n2)初步研磨：/n将球状助研磨体加入步骤1)所得固态发酵曲料中，加入液氮并进行研磨，使曲料表面的菌体剥离脱落，同时保持曲料中原料颗粒完整；/n3)在初步研磨后，将所述原料颗粒除去，得到菌体混合物；/n4)充分研磨步骤3)所得菌体混合物，获得含菌体RNA的粉末料；/n5)向步骤4)所得粉末料中加入总RNA提取剂，提取总RNA，即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)预处理：
筛选原料颗粒完整、饱满的固态发酵曲料样品，进行冷冻处理；
2)初步研磨：
将球状助研磨体加入步骤1)所得固态发酵曲料中，加入液氮并进行研磨，使曲料表面的菌体剥离脱落，同时保持曲料中原料颗粒完整；
3)在初步研磨后，将所述原料颗粒除去，得到菌体混合物；
4)充分研磨步骤3)所得菌体混合物，获得含菌体RNA的粉末料；
5)向步骤4)所得粉末料中加入总RNA提取剂，提取总RNA，即得。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中曲料为豆豉、酱油或豆酱固态发酵所得曲料。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中冷冻处理的温度为-75～-86℃，优选为-80℃。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢景毅，侯莎，王晓文，童星，吴昌正，
申请(专利权)人：广东海天创新技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44