用于向细胞外囊泡装载化学和生物试剂/分子的组合物和方法技术

提供了被称为EXO‑Code的RNA核苷酸序列，以及包含EXO‑Code的较长RNA多核苷酸。EXO‑Code为RNA提供了以下能力：a)被选择性地分选至细胞外囊泡(例如外泌体)，以及b)递送多种运载物类型以对细胞外囊泡和接收外泌体的细胞进行编程或重编程。还提供了制备EXO‑Code的方法、使用EXO‑Code修饰细胞的方法、编码EXO‑Code的表达载体、以及包含含有EXO‑Code的RNA多核苷酸的外泌体和其他分泌囊泡。

Compositions and methods for loading chemical and biological agents / molecules into extracellular vesicles

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于向细胞外囊泡装载化学和生物试剂/分子的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年5月11日提交的美国临时申请号62/504,941和2018年2月15日提交的美国临时申请号62/631,060的优先权，其公开内容因此通过引用并入。政府基金本专利技术是在由美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的基金号HL126082、EB021454和EB023262的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
本公开内容总体上涉及用于向外泌体/细胞外囊泡装载化学和生物试剂和/或用于调节外泌体/细胞外囊泡的运载物(cargo)分选的组合物和方法。
技术介绍
在1毫升的人血液中，存在大约十亿个外泌体：包含蛋白质、miRNA和mRNA的脂质囊泡。细胞将外泌体释放到细胞外环境中，在那里它们参与许多生理和病理生理过程。外泌体起源于多囊泡体(multivesicularbodie，MVB)，其在释放到细胞外环境之前与浆细胞膜融合。释放时，外泌体可与邻近的细胞融合以转移其运载物。现已知道，外泌体并不仅仅是不需要的细胞蛋白质和“垃圾RNA”的运载体(vehicle)，而且细胞主动分泌外泌体以调节其微环境。外泌体参与多种疾病的发病机理，包括癌症、神经变性、自身免疫和肝脏疾病。多项研究已经检查了外泌体在癌症生长和转移中的作用[Costa-SilvaB等人NatCellBiol.2015；17(6):816-826；GrangeC等人Cancerresearch.2011；71(15):5346-5356；HoodJL等人Cancerresearch.2011；71(11):3792-3801；KucharzewskaP等人ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.2013；110(18):7312-7317；PeinadoH等人NatMed.2012；18(6):883-891]。由于来源于肿瘤细胞的细胞外囊泡(例如外泌体)有将脂肪来源的间充质干细胞转化为肿瘤相关的肌成纤维细胞潜力，因此已经提出这些外泌体可通过产生肿瘤基质而促进肿瘤进展和恶性表型[ChoJA等人IntJOncol.2012；40(1):130-138]。外泌体在诱导转移中也发挥着作用，最终导致超过90％的癌症相关死亡：转移性疾病的治疗仍然是临床挑战。癌细胞来源的外泌体有可能将其直接微环境中的健康细胞转化为肿瘤形成细胞：由癌细胞释放的外泌体可以将癌基因(主要通过致癌小RNA)转移至受体细胞，诱导癌细胞迁移并促进血管生成，这是重要的癌症“标志”[MeehanK等人CritRevClinLabSci.2015:1-11]。由于其固有的全身扩散能力，它们还可以通过准备转移前微环境(pre-metastaticniche)来在远处位点引发新的肿瘤生长。特别地，已经显示出来自肺向性4175-LuT癌细胞(MDA-MB-231乳腺癌子系)的外泌体是如何在全身性施用后特异性地定位至肺部并且被肺部驻留的成纤维细胞摄取。这些外泌体不仅能够使骨向性肿瘤细胞的迁移从骨部位定向至肺，还能使那些细胞在肺中的转移能力提高10,000倍[HoshinoA等人Nature.2015；527(7578):329-335]。这些数据表明，循环的外泌体为将来的转移性肿瘤准备了离散的位点，符合种子-土壤假说。外泌体和/或细胞外囊泡在生理过程中也发挥作用，并且可具有再生作用。例如，已经显示来源于间充质干细胞(MSC)的外泌体/细胞外囊泡在心肌梗死后通过调节受损的组织环境、诱导血管生成并诱导细胞增殖和分化来介导心脏组织修复[BarileL等人CardiovascRes.2014；103(4):530-541；LaiRC等人Stemcellresearch.2010；4(3):214-222]。因此，对可用于通过将外泌体重编程以阻止和/或逆转疾病进展来阻断不希望的细胞通讯并且可用于将外泌体重编程或装载化学和生物试剂使得其可以将其它期望运载物递送至靶细胞的组合物和方法存在着持续且未被满足的需求。本公开内容与这些需求有关。
技术实现思路
本公开内容涉及RNA多核苷酸序列(在本文中不时称为“EXO-Code”)，其能够a)被选择性地分选至细胞外囊泡(例如外泌体)，并且b)递送多种运载物类型以对细胞外囊泡进行编程或重编程。尽管使用外泌体说明了本公开内容的非限制性实施例，但是本公开内容包括使用EXO-Code将含有EXO-Code的多核苷酸分选至任何分泌的膜结构，包括但不限于外泌体、囊泡、微囊泡、微颗粒、内体来源的囊泡、多囊泡体、凋亡小体及其组合。在某些方面，本公开内容包括含有EXO-Code的试剂，其包含RNA片段，其中所述RNA片段包含EXO-Code序列，并且其中所述试剂还包含运载物部分。所述运载物部分可选自多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、荧光团和小(药物)分子。本公开内容包括将任何经修饰的多核苷酸和/或经修饰的外泌体和/或经修饰的细胞组合物的作用与合适的参考进行比较。参考可以包括经修饰的多核苷酸和/或经修饰的外泌体和/或经修饰的细胞组合物的功能的任何合适的对照值或者测量量，例如标准曲线、滴定、曲线下面积，或者与天然存在的组合物或过程的能力，包括但不限于未经修饰的或其它对照系统中RNA外泌体分选的效率、动力学、量等的比较。本公开内容包括组合物，包括但不限于适用于人和/或兽医用途的药物组合物，其中所述组合物包含含有EXO-Code的多核苷酸。药物组合物通常包含至少一种药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂等。本公开内容包括经修饰以产生包含含有EXO-Code的多核苷酸的外泌体的细胞培养物，包含所述外泌体的细胞培养基以及分离和/或纯化的外泌体群体，其中所述群体中的至少一些外泌体包含含有EXO-Code的多核苷酸。本公开内容包括包含外泌体的药物组合物，所述外泌体包含含有EXO-Code的多核苷酸。本公开内容包括制备含有EXO-Code的多核苷酸的方法，例如通过化学合成或者体外或体内转录。还包括含有EXO-Code的不同多核苷酸的组合，其中所述组合具有大于叠加的或协同的对至少一种EXO-Code/外泌体分选特性的作用和/或对引入了本公开内容的经修饰的外泌体的细胞的作用。本公开内容的多核苷酸可包含一个或多于一个EXO-Code序列，并且可包含多于一个相同的EXO-Code序列或不同的EXO-Code序列。更详细地，多价是设计两个部分之间更高亲和力相互作用的良好建立的方法。可以将基本上无限数量的EXO-Code和不同EXO-Code的组合引入任何单个多核苷酸中，以用于实现增强的外泌体递送的潜力。但是，随着引入更多的EXO-Code，在增加的亲和力与多核苷酸的尺寸之间可能存在反比关系。因此，在一些非限制性实施例中，本公开内容的多核苷酸包含1、2、3或更多个EXO-Code。此外，尽管当直接电穿孔到活细胞中以进行有效的外泌体包装时可以实现EXO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA多核苷酸或编码所述RNA多核苷酸的DNA载体，其中所述RNA多核苷酸包含至少一个本文所述的RNA EXO-Code序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170511 US 62/504,941;20180215 US 62/631,0601.一种RNA多核苷酸或编码所述RNA多核苷酸的DNA载体，其中所述RNA多核苷酸包含至少一个本文所述的RNAEXO-Code序列。


2.根据权利要求1所述的RNA多核苷酸，其中所述RNAEXO-Code包含以下序列：
5’-GCUGGUCAGGAUGCGGGGGC-3’(S6)(SEQIDNO:26)，
5’-CCGGGCGUAUCUUGUGGUCG-3’(M8)(SEQIDNO:18)，或
5’-AAGUGGCGUG-3’(HB)SEQIDNO:208。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的RNA多核苷酸，其中所述RNA多核苷酸包含运载物部分，其中所述运载物部分是：i)另外的多核苷酸片段，其中所述另外的多核苷酸片段包含功能性多核苷酸片段，或者其中所述运载物部分是：ii)肽、多肽、荧光团或小药物分子。


4.根据权利要求3所述的RNA多核苷酸，其中所述RNA多核苷酸被膜结构包含。


5.根据权利要求3所述的RNA多核苷酸，其中所述膜结构是以下中的一种：外泌体、囊泡、微囊泡、微颗粒、内体来源的囊泡、多囊泡体或凋亡小体。


6.根据权利要求5所述的RNA多核苷酸，其中所述RNA多核苷酸被所述外泌体包含。


7.根据权利要求4-6中任一项所述的RNA多核苷酸，其中存在所述功能性多核苷酸片段，并且其中所述功能性多核苷酸片段包含以下序列：短发夹RNA(shRNA)、或短干扰RNA(siRNA)、或微小RNA(miRNA)、或成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)指导RNA。


8.一种方法，包括向细胞或另一膜结构中引入如权利要求1的RNA多核苷酸。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述RNA多核苷酸包含以下序列：
5’-GCUGGUCAGGAUGCGGGGGC-3’(S6)(SEQIDNO:26)，
5’-CCGGGCGUAUCUUGUGGUCG-3’(M8)(SEQIDNO:18)，或
5’-AAGUGGCGUG-3’(HB)SEQIDNO:208。


10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述RNA多核苷酸包含运载物部分，其中所述运载物部分是：i)另外的多核苷酸片段，其中所述另外的多核苷酸片段包含功能性多核苷酸片段，或者其中所述运载物部分是：ii)肽、多肽、荧光团或小药物分子。


11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述RNA多核苷酸引入所述细胞，其中所述细胞是真核细胞，并且其中所述RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱莉安·阮，斯科特·弗格森，
申请(专利权)人：纽约州立大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US