渗透性冷冻保护剂及其制备和使用方法技术

提供了适合细胞的冷冻保存的化合物。所述化合物是无毒、水溶性的且不含任何有机溶剂。所述化合物具有以下式(I)的结构，其中n是1、2、3或4并且每个R独立地是H或式(II)，其中每个R'独立地选自脂肪族基团、芳基基团和氨基酸基团并且至少一个R不是H并且带星号的碳具有R或S立体化学或其外消旋体。还提供了使用所述化合物冷冻保存细胞群的组合物和方法。物冷冻保存细胞群的组合物和方法。物冷冻保存细胞群的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】渗透性冷冻保护剂及其制备和使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年12月21日提交的美国临时申请号63/128,765的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

技术介绍

[0003]冷冻保存在几乎所有水平的再生医学中都是需要的，并且为细胞、组织和器官的长期储存提供了唯一安全且具有成本效益的选择。冷冻保护剂(CPA)是用作关键添加剂的物质，其能够提高冷冻保存的生物样品解冻后的活力。通过防止结冰，CPA有助于避免生物样品在冷却时受到冷冻损伤。已知有两类CPA：不进入细胞并在细胞外空间发挥作用的非渗透性CPA；或进入细胞内空间的渗透性CPA。细胞的成功保存需要细胞内和外CPA的存在。虽然多种物质(包括不能渗透膜的小分子(例如糖)和大的长链聚合物)已被用作非渗透性CPA，但渗透性CPA的可用性仍然非常有限，二甲亚砜(DMSO)和较低程度上甘油是最常用的渗透性CAP。不幸的是，DMSO具有毒性，这使其无法用于许多应用。对于涉及DMSO的保存，细胞只能在包含DMSO的冷冻保存溶液中被孵育限于短的冷冻前和解冻后时间。此外，DMSO和甘油在冷冻保存中以高(10
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50％或更高)细胞外浓度应用，并且在解冻过程中需要大量洗涤以防止细胞死亡或随后用于医学治疗时的不良反应。除了少数膜渗透性CPA(例如DMSO和甘油)外，大多数已知的具有极好抗冻性能的分子对哺乳动物细胞膜来说是不可渗透的。
[0004]尽管许多其它CPA已被探索作为替代的渗透性CPA，但很少表现出与甘油或DMSO相同的功效。目前迫切需要不含DMSO的冷冻培养基，因为随着时间的推移，细胞在不含DMSO的溶液中比在含DMSO的培养基中更稳定。因此，对能够渗透细胞膜的新型、有效、无毒CPA的研究仍在继续。
[0005]发现糖醇(多元醇)例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、核糖醇、赤藓糖醇和苏糖醇以及多种糖和氨基酸在冬季极低温度下生存的大多数耐冻昆虫中积累。已经在许多物种的体液中报道了高多元醇浓度(>2M)。然而，与二糖一样，除甘油外，常见的糖醇渗透细胞膜的能力非常差或无法渗透细胞膜。当添加到细胞培养培养基中时，这些分子在细胞外发挥作用，为细胞提供的冷冻保护不足或没有冷冻保护。

技术实现思路

[0006]本公开提供了酯化多元醇。还提供了制备包含酯化多元醇的组合物的方法。还提供了使用酯化多元醇和组合物的方法。
[0007]本文公开的化合物能够利用无毒、水溶性且不含任何有机溶剂的CPA冷冻保存细胞。将已知具有抗冻作用但无法渗透细胞膜的物质修饰成膜可渗透的衍生物，然后在细胞内转化回其原始活性形式。最终结果是将许多容易获得、无毒但未被充分利用的物质在细胞内递送到实际可用的、有效的细胞内CPA中，从而实现无DMSO的细胞冷冻保存。
[0008]一方面，本公开提供了酯化多元醇。前体多元醇的一个或多个或全部醇基团被酯化以形成酯化多元醇。酯化多元醇可以被称为冷冻保护剂(CPA)。酯化多元醇可以自始至终
被称为“化合物”。
[0009]一方面，本公开提供了包含一种或多种本公开的酯化多元醇的组合物。该组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。
[0010]一方面，本公开提供了使用一种或多种本公开的酯化多元醇的方法。一种或多种酯化多元醇可以用于制备用于冷冻保存的细胞群的方法或用于冷冻保存细胞群的方法。
附图说明
[0011]为了更全面地理解本公开的本质和目的，应当参考以下结合附图的详细描述。
[0012]图1显示了携带多个羟基(OH)基团的水溶性、膜不可渗透的A与带有疏水性片段和羧基(COOH)基团的B偶联，得到能够渗透细胞膜并进入细胞的酯A
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B。在细胞内酯酶的催化下，内化的酯AB被水解回A和B。(A＝具有已知抗冻能力的水溶性化合物；B＝具有疏水性片段且具有或不具有抗冻能力的化合物)。
[0013]图2显示了糖醇(a)与羧酸(b)偶联产生酯ESA
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1、ESA
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2和ESA
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3。
[0014]图3显示了衍生自葡萄糖、甘露糖和果糖的酯ESA
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1、ESA
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2和ESA
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3。
[0015]图4显示了衍生自蔗糖和海藻糖的酯ESU和ETR。
[0016]图5显示了检查衍生自甘油和山梨糖醇的酯的冷冻保存功效。
[0017]图6显示了在有或没有GLC3P的情况下冷冻保存的NIH
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3T3细胞的细胞活力数据。细胞活力通过CCK
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8测定获得，其中将来自10％ DMSO的细胞的细胞活力设为100％。
[0018]图7显示了在有或没有SBT6P的情况下冷冻保存的NIH
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3T3细胞的细胞活力数据。细胞活力通过CCK
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8测定获得，其中将来自10％ DMSO的细胞的细胞活力设为100％。
[0019]图8显示了在有或没有SBT2A
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1和SBT2A
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2的情况下冷冻保存的NIH
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3T3细胞的细胞活力数据。细胞活力通过CCK
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8测定获得，其中将来自10％ DMSO的细胞的细胞活力设为100％。
[0020]图9显示了山梨糖醇和蔗糖的酰化方案。
[0021]图10显示了酰化的合成方案。
[0022]图11显示用仅培养基(对照)以及在具有SorbPr2(10mM)和MannPr2(10mM)的培养基中孵育48小时的NIH
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3T3细胞的平均直径(培养基＝具有10％FBS的DMEM)。直径表示为基于三个重复测量的平均值
±
SD。每组分析至少1000个细胞。使用单因素方差分析进行统计分析，**＝p<0.01，****＝p<0.0001。
[0023]图12显示了冷冻保存的NIH
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3T3细胞在解冻后0小时和48小时的总细胞恢复率值(表示为基于三个独立测量的平均值
±
SEM)。将细胞在具有5mM和10mM二酯SorbPr2(10mM)的培养基中孵育，并用仅培养基孵育，然后在包含海藻糖(400mM)的培养基中冷冻。(培养基＝DMEM+10％FBS)。
[0024]图13显示冷冻保存的NIH
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3T3细胞在解冻后立即(0小时)、24小时和48小时的总细胞恢复率值(表示为基于三个独立测量的平均值
±
SEM)。将细胞在具有二酯MannPr2、SorbPr2、XylPr2或EryPr2(10mM)以及未修饰的甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇或赤藓糖醇(10mM)的培养基中孵育，然后在包含海藻糖(400mM)的培养基中冷冻。对照
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1：细胞用仅培养基孵育，然后在包含海藻糖(400mM)的培养基中冷冻；对照
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种酯化多元醇，其中所述酯化多元醇具有以下结构：其中n是1、2、3或4并且每个R独立地是H或其中每个R'独立地选自脂肪族基团、芳基基团和氨基酸基团并且至少一个R不是H，其中带星号的碳具有R立体化学或S立体化学，并且当所述酯化多元醇具有以下结构时：一个或多个碳具有R或S立体化学。2.根据权利要求1所述的酯化多元醇，其中每个脂肪族基团选自CH3基团、C2H5基团、直链和支链C3H7基团、直链和支链C4H9基团、直链和支链C5H
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基团以及直链和支链C6H
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基团。3.根据权利要求1所述的酯化多元醇，其中所述芳基基团是苯基基团或其中m是1、2、3、4或5。4.根据权利要求1所述的酯化多元醇，其中所述氨基酸基团是经典氨基酸基团、非经典氨基酸基团或基于N
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官能化的甘氨酸的衍生物。5.根据权利要求1所述的酯化多元醇，其中所述酯化多元醇具有以下结构：5.根据权利要求1所述的酯化多元醇，其中所述酯化多元醇具有以下结构：6.根据权利要求5所述的酯化多元醇，其中所述酯化多元醇是：
或其盐。7.根据权利要求6所述的酯化多元醇，其中所述酯化多元醇是：8.根据权利要求1所述的酯化多元醇，其中所述酯化多元醇是：
9.一种酯化多元醇，具有以下结构：其中n是1、2、3或4并且每个R独立地是H、糖基团或其中每个R'独立地选自脂肪族基团、芳基基团和氨基酸基团，并且至少一个R不是H并且一个或多个碳具有R或S立体化学。10.根据权利要求9所述的酯化多元醇，其中所述二糖是蔗糖或海藻糖。11.根据权利要求9所述的酯化多元醇，其中所述酯化多元醇具有以下结构：12.根据权利要求9所述的酯化多元醇，其中每个脂肪族基团选自CH3基团、C2H5基团、直链和支链C3H7基团、直链和支链C4H9基团、直链和支链C5H<...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚兵，钟彧龙，
申请(专利权)人：纽约州立大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：