人肝前体细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供一种在生物体外将人成熟肝细胞重编程为具有自我复制能力的肝前体细胞的方法。一种人肝前体细胞的制备方法，包括将人成熟肝细胞在含有血清、A‑83‑01和CHIR99021的培养基中进行培养。

Preparation of human hepatic precursor cells

The invention provides a method for reprogramming human mature hepatocytes into self-replicating hepatic precursor cells in vitro. A method for preparing human hepatic precursor cells includes culturing human mature hepatocytes in a medium containing serum, A_83_01 and CHIR99021.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人肝前体细胞的制备方法
本专利技术涉及人肝前体细胞的制备方法。
技术介绍
针对严重的肝疾病的有效的治疗方法现在仅为肝移植，但绝对的供体不足成为问题。为了代替肝移植，迄今为止持续进行了由iPS细胞分化诱导肝细胞并用于移植治疗的尝试。然而，由于iPS细胞具有分化全能性和高的增殖能力，因此，也有随着对免疫缺陷小鼠的移植而形成畸胎瘤的报告，在由iPS细胞制作肝细胞时即使稍微混入未分化iPS细胞时，产生在移植后形成肿瘤的危险性。另外，由于使用iPS细胞来向肝脏等的内胚叶细胞进行高效分化的诱导法尚未确立，现状是，不可能由iPS细胞制作能够代替肝功能程度的肝细胞。针对这种情况，在成体肝脏内极少数存在的肝前体细胞也开始被认为是可利用的细胞来源。另外，最近的研究表明：在慢性肝炎时，成熟肝细胞被重编程为具有分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双分化能力的前体细胞(非专利文献1～4)。现有技术文献非专利文献非专利文献1:YangerK.et.al.,Genes&Development,pp.719-724,27,2013非专利文献2:TanimizuN.et.al.,JournalofBiologicalChemistry,pp.7589-7598,289(11),2014非专利文献3:YimlamaiD.et.al.,Cell,pp.1324-1338,157,2014非专利文献4:TarlowB.D.et.al.,CellStemCell,pp.605-618,15,2014
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供在生物体外将人成熟肝细胞重编程为具有自我复制能力的人肝前体细胞的方法。本专利技术人等为了解决本课题反复进行了深入研究，结果发现通过在生物体外将人成熟肝细胞在含有血清、A-83-01(TGF-β信号抑制剂)和CHIR99021(GSK3抑制剂)的培养基中进行培养，从而能够重编程为具有自我复制能力的人肝前体细胞，以至完成了本专利技术。即，本专利技术提供以下所示的人肝前体细胞的制备方法。项1.一种人肝前体细胞的制备方法，包括将人成熟肝细胞在含有血清、A-83-01和CHIR99021的培养基中进行培养。项2.根据项1所述的人肝前体细胞的制备方法，其中，所述人成熟肝细胞来自婴幼儿。项3.根据项1或2所述的人肝前体细胞的制备方法，其中，所述血清为胎牛血清。项4.一种人肝前体细胞，是通过将人成熟肝细胞在含有血清、A-83-01和CHIR99021的培养基中进行培养而制备的。项5.一种成熟肝细胞，是由项4所述的人肝前体细胞诱导而得的。项6.一种被检物质的筛选方法，包括使用项5所述的成熟肝细胞。项7.一种肝炎病毒的培养方法，包括使用项5所述的成熟肝细胞。项8.一种人肝脏模型动物，是将项5所述的成熟肝细胞移植于非人哺乳动物而得的。项9.一种试剂盒，是用于使用人肝前体细胞或成熟肝细胞来评价被检物质的代谢和/或肝毒的试剂盒，包含人肝前体细胞或成熟肝细胞，所述人肝前体细胞是通过将人成熟肝细胞在含有血清、A-83-01和CHIR99021的培养基中进行培养而制备的，所述成熟肝细胞是由该人肝前体细胞诱导而得的。根据本专利技术，能够提供在生物体外将人成熟肝细胞重编程为具有自我复制能力的肝前体细胞的方法。附图说明图1是表示将人成熟肝细胞在AC-F培养基(A)、YAC-F培养基(B)或YAC培养基(C)中进行培养的结果的相位差显微镜照片。图2是表示将人成熟肝细胞在AC-F培养基中进行培养的结果的相位差显微镜照片。图3是表示将人成熟肝细胞在AC-F培养基或FBS培养基中进行培养的结果的相位差显微镜照片。图4是表示将人成熟肝细胞在AC-F培养基或FBS培养基中进行培养的结果的相位差显微镜照片。图5是表示对cDNA-uPA/SCID小鼠给予肝前体细胞后的血中人特异性白蛋白的经时变化的图表。图6是表示对cDNA-uPA/SCID小鼠给予肝前体细胞70天后的内侧右叶中的人CYP2C9的表达的免疫染色照片。图7是表示对cDNA-uPA/SCID小鼠给予肝前体细胞70天后的内侧左叶中的人CYP2C9的表达的免疫染色照片。图8是表示对TK-NOG小鼠给予肝前体细胞后的血清中人特异性白蛋白的经时变化的图表。图9是表示对TK-NOG小鼠给予肝前体细胞60天后的肝脏中的人CYP2C9的表达的免疫染色照片。图10是表示对TK-NOG小鼠给予肝前体细胞60天后的肝脏中的人CYP2C9的表达的免疫染色照片。图11是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的代谢酶CYP1A2的活性的图表。图12是表示由本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的有无利用奥美拉唑的诱导下的代谢酶CYP1A2的活性比率的图表。图13是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的代谢酶CYP3A4的活性的图表。图14是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的有无利用苯巴比妥的诱导下的代谢酶CYP3A4的活性比率的图表。图15是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的ALB的基因表达量的图表。图16是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的TAT的基因表达量的图表。图17是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的TDO2的基因表达量的图表。图18是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的TTR的基因表达量的图表。图19是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的G6PC的基因表达量的图表。图20是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的NTCP的基因表达量的图表。图21是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的CYP1A2的基因表达量的图表。图22是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的CYP2B6的基因表达量的图表。图23是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的CYP2C9的基因表达量的图表。图24是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的CYP2C19的基因表达量的图表。图25是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的CYP2D6的基因表达量的图表。图26是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的CYP3A4的基因表达量的图表。图27是表示本专利技术的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的CYP7A1的基因表达量的图表。图28是对cDNA-uPA/SCID小鼠移植前的本专利技术的肝前体细胞的照片。图29是对cDNA-uPA/SCID小鼠移植本专利技术的肝前体细胞后，取出，进行4天培养的细胞的照片。图30是表示从cDNA-uPA/SCID小鼠取出的肝细胞中的CYP1A2的活性的图表。图31是表示从cDNA-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人肝前体细胞的制备方法，包括将人成熟肝细胞在含有血清、A‑83‑01和CHIR99021的培养基中进行培养。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.28 JP 2016-2122851.一种人肝前体细胞的制备方法，包括将人成熟肝细胞在含有血清、A-83-01和CHIR99021的培养基中进行培养。2.根据权利要求1所述的人肝前体细胞的制备方法，其中，所述成熟肝细胞来自婴幼儿。3.根据权利要求1或2所述的人肝前体细胞的制备方法，其中，所述血清为胎牛血清。4.一种人肝前体细胞，是通过将人成熟肝细胞在含有血清、A-83-01和CHIR99021的培养基中进行培养而制备的。5.一种成熟肝细胞，是由权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：胜田毅，落谷孝广，山田哲正，
申请(专利权)人：国立研究开发法人国立癌研究中心，株式会社因特斯迪姆，
类型：发明
国别省市：日本,JP