本发明专利技术公开了一种长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星状细胞的分离方法，长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法包括；将供体麻醉，将供肝从供体切取出；将受体麻醉，切除肝脏，将供肝植入切除肝脏的受体中；计算长爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。本发明专利技术施行长爪沙鼠原位肝移植，观察长爪沙鼠原位肝移植模型的变化，计算成活率。一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，包括：用水合氯醛腹腔内注射麻醉雄性长爪沙鼠或选用刚刚死亡的雄性长爪沙鼠，将供肝从供体切取出；从供肝中分离得到的肝星状细胞。本发明专利技术分离方法能够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及长爪沙鼠肝移植和细胞分离
，具体涉及长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星状细胞的分离方法。
技术介绍
稳定、可靠的肝移植动物模型是临床肝移植和免疫耐受研究的基础。只有成熟稳定的动物模型作为技术平台，器官移植和免疫耐受研究的发展才能有质的飞跃。虽然大鼠肝移植模型是目前较为常用的动物模型，但封闭群大鼠用于该模型，其稳定性和重现性有待进一步提高，而近交系大鼠模型稳定性提高了，但由于资源相对匮乏，不易获取，而且较为昂贵，因此进一步寻求稳定，易得的实验动物肝移植模型，对于研究工作的进行至关重要。小动物肝移植模型目前最常用的手术方式有单套管法(即门静脉行套管吻合)，双套管法(门静脉、肝下下腔静脉行套管吻合，而肝上上腔静脉采用缝合法)，三套管法(门静脉、肝下下腔静脉、肝上上腔静脉均用套管吻合法)。单套管法最主要的缺点是无肝期及受体总体手术时间相对较长，目前公认这两个时间的长短是术后存活情况的关键，缩短手术期及无肝期可减轻受体血流动力学、生化等方面的病理生理改变，减轻供肝的缺血再灌注损伤，因此，目前已经较少采用该术式。而三套管法虽然能有效减少无肝期(较双套管法平均缩短5～6分钟)，但在该法中，肝上上腔静脉较容易发生套管扭曲、脱落及血管通而不畅的并发症。长爪沙鼠又称蒙古沙鼠(Meriones Unguieulataus，Mongolian gerbil)，分类学上属于啮齿目、仓鼠科、沙鼠亚科、沙鼠属。近年来，作为重要的实验动物资源，长爪沙鼠在国内的使用率越来越高，其应用领域也不断扩大，国家“十一五”、“十二五”科技支撑计划，相继将长爪沙鼠的标准化及其动物模型开发纳入实验动物领域重大资助项目。长爪沙鼠由于其独特的生理、解剖学和行为学特征，成为一种正在进行开发有着广阔应用前景的多功能实验动物。申请人前期研究表明长爪沙鼠脂质代谢与人类相似，连续16周高
脂饲料喂养，长爪沙鼠可发生脂肪肝系列病变最终导致肝纤维化的发生，提示长爪沙鼠在肝硬化方面的研究是很有价值的模型动物，而肝移植是临床上治疗终末期肝硬化的根本解决办法，因此，长爪沙鼠原位肝移植模型的建立将为终末期肝硬化疾病的肝移植治疗与观察提供动物模型及技术支持。另现有大量文献表明，长爪沙鼠对多种细菌、病毒和寄生虫等病原体(如幽门螺旋杆菌、流行性出血热病毒、布鲁丝虫等)的感染非常敏感，是理想的感染性疾病模型动物。因此本文所建立的长爪沙鼠原位肝移植模型将进一步用于观察长爪沙鼠肝移植后的免疫反应，填补长爪沙鼠在器官移植中免疫学研究的空白。目前，国内外尚无文献报道长爪沙鼠应用于器官移植，故本文以长爪沙鼠作为供、受体，为长爪沙鼠在肝移植中的应用搭建良好的技术平台，填补该动物在器官移植中的空白。
技术实现思路
针对现有不足，本专利技术的目的是提供一种长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，施行长爪沙鼠原位肝移植，观察长爪沙鼠原位肝移植模型的变化，计算成活率。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，包括；1)将供体麻醉，将供肝从供体切取出；2)将受体麻醉，切除肝脏，将供肝植入切除肝脏的受体中；3)计算长爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。步骤1)中，所述的供体麻醉的条件为：采用100～140mg/kg氯胺酮腹腔注射，即采用100～140mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉后进行供肝切取，进一步优选，采用120mg/kg氯胺酮腹腔注射。将供肝从供体切取过程中，采用的胆管支架由硬膜外导管制成，两端修成斜面，长为4.0～6.0mm，外径为0.8～1.2mm，进一步优选，长为5.0mm，外径为1.0mm。将供肝从供体切取过程中，采用的血管套管由聚乙烯塑料管制成，血管套管包括套管体以及与所述套管体连接的套管柄，套管柄的长度为1.5～2.5mm，门静脉血管套管的内径为1.5～2.3mm，外径为1.8～2.4mm，肝下下腔静脉血管套管内径为2.2～2.6mm，外径为2.4～3.2mm，进一步优选，套管柄的长度为2.0mm，门静脉血管套管的内径为1.8mm，外径为2.1mm，肝
下下腔静脉血管套管内径为2.6mm，外径为2.8mm。将供肝从供体切取过程中，供体腹部被打开、暴露供肝后，用生理盐水纱布覆盖供肝。将供肝从供体切取过程中，供体经腹主动脉用生理盐水灌注至肝脏呈土黄色时即表示灌注良好。将供肝从供体切取过程中，胆管支架和血管套管均放置在0～4℃的生理盐水冰浴中进行。进一步优选地，所述的生理盐水的温度为0～4℃、含20～30U/ml肝素；灌注速度为2.0～3.0ml/min；灌注用量为10～30ml。更进一步优选，所述的生理盐水的温度为0～4℃、含25U/ml肝素；灌注速度为2.5ml/min；灌注用量为20ml。步骤2)中，所述的受体麻醉的条件为：采用40～60mg/kg氯胺酮腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉，即采用40～60mg/kg氯胺酮腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉下进行切除肝脏、植入供肝的，进一步优选，采用50mg/kg氯胺酮腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉。一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，包括：a)用水合氯醛腹腔内注射麻醉雄性长爪沙鼠或选用刚刚死亡的雄性长爪沙鼠，将供肝从供体切取出；b)将供肝，先移入联合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝脏呈糊状，再移入混合酶液，搅拌消化，得到搅拌消化后的产物；c)向搅拌消化后的产物中加入第一Hank’s液，过滤，得肝组织；然后向肝组织中加第二Hank’s液，初步离心，得沉淀；用第三Hank’s液重悬沉淀，再向其加入Nycodenz液混匀，再次离心，得浑浊带，浑浊带即为分离得到的肝星状细胞。本专利技术的分离方法，成功地分离了长爪沙鼠的肝星状细胞，简便可行，并为进一步研究HSC与肝纤维化的关系奠定了基础。同时，本专利技术方法能够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度，为进一步研究肝星状细胞在肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化的形成奠定了基础。步骤a)中，将供肝从供体切取过程中，采用的胆管支架由硬膜外导管制成，两端修成斜面，长为4.0～6.0mm，外径为0.8～1.2mm，进一步优选，长为5.0mm，外径为1.0mm。将供肝从供体切取过程中，采用的血管套管由聚乙烯塑料管制成，血管
套管包括套管体以及与所述套管体连接的套管柄，套管柄的长度为1.5～2.5mm，门静脉血管套管的内径为1.5～2.3mm，外径为1.8～2.4mm，肝下下腔静脉血管套管内径为2.2～2.6mm，外径为2.4～3.2mm，进一步优选，套管柄的长度为2.0mm，门静脉血管套管的内径为1.8mm，外径为2.1mm，肝下下腔静脉血管套管内径为2.6mm，外径为2.8mm。将供肝从供体切取过程中，供体腹部被打开、暴露供肝后，用生理盐水纱布覆盖供肝。将供肝从供体切取过程中，供体经腹主动脉用生理盐水灌注至肝脏呈土黄色时即表示灌注良好。将供肝从供体切取过程中，胆管支架和血管套管均放置在0～4℃的生理盐水冰浴中进行。所述的供肝从供体切取出具体包括以下步骤：I、用水合氯醛腹腔内注射麻醉雄性长爪沙鼠或选用刚刚死亡的雄性长爪沙鼠，将雄性长爪沙鼠仰卧位固定，消毒，腹部行十字切口，止血钳夹住剑突向头侧牵引固定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，包括；1)将供体麻醉，将供肝从供体切取出；2)将受体麻醉，切除肝脏，将供肝植入切除肝脏的受体中；3)计算长爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。
【技术特征摘要】
1.一种长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，包括；1)将供体麻醉，将供肝从供体切取出；2)将受体麻醉，切除肝脏，将供肝植入切除肝脏的受体中；3)计算长爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。2.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤1)中，所述的供体麻醉的条件为：采用100～140mg/kg氯胺酮腹腔注射。3.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤1)中，将供肝从供体切取过程中，采用的胆管支架由硬膜外导管制成，两端修成斜面，长为4.0～6.0mm，外径为0.8～1.2mm。4.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤1)中，将供肝从供体切取过程中，采用的血管套管由聚乙烯塑料管制成，血管套管包括套管体以及与所述套管体连接的套管柄，套管柄的长度为1.5～2.5mm，门静脉血管套管的内径为1.5～2.3mm，外径为1.8～2.4mm，肝下下腔静脉血管套管内径为2.2～2.6mm，外径为2.4～3.2mm。5.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤1)中，将供肝从供体切取过程中，供体腹部被打开、暴露供肝后，用生理盐水纱布覆盖供肝；将供肝从供体切取过程中，供体经腹主动脉用生理盐水灌注至肝脏呈土黄色时即表示灌注良好。6.根据权利要求5所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤1)中，所述的生理盐水的温度为0～4℃、含20～30U/ml肝素；灌注速度为2.0～3.0ml/min；灌注用量为10～30ml。7.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤2)中，所述的受体麻醉的条件为：采用40～60mg/kg氯胺酮腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉。8.一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，其特征在于，包括：a)用水合氯醛腹腔...
【专利技术属性】
技术研发人员：楼琦，石巧娟，卢领群，李巍，郭红刚，杜江涛，应华忠，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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