一种提高乌鳢三倍体育成率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤：他莫昔芬喂养料的配备、对乌鳢母本进行投喂他莫昔芬喂养料、冷休克+静水压处理、雌激素抑制剂溶液的配制、取受精卵放入雌激素抑制剂溶液中常温浸泡、取鱼苗投喂氯米芬幼体料、取雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式获得三倍体。通过此方法，可获得100%的乌鳢三倍体纯系，提高了三倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选种的麻烦，更主要的是对自然水产品种种质和生态环境无污染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及乌鳢的多倍体繁育方法，具体涉及一种提高乌鳢三倍体育成率的方法。
技术介绍
乌鳢俗称黑鱼，生性凶猛，繁殖力强，胃口奇大，体色呈灰黑色，生长速度快。三倍体乌鳢的不育特征，使其在抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出更为显著的优势。现有技术中，不育三倍体乌鳢是通过四倍体与二倍体倍间杂交获得，但要获得98%以上的三倍体乌鳢，那么就需要建立遗传稳定、纯度极高的四倍体鱼系。在鱼类遗传育种中，通常利用冷/热休克，或通过杂交等方法抑制受精卵的第一次有丝分裂或直接异源染色体加倍，制备出同源或异源四倍体鱼，其中冷休克一般是与静水压处理一起，难以获得较高纯度的四倍体系，而热休克的方式虽然易于操作，同样，难以获得纯度高的四倍体系；而杂交的方法虽然纯度高，但成功率低、周期长。此外，上述这些方法制备的四倍体鱼，有些可育、有些又不可育，同时也可能存在基因混杂现象（异源四倍体），容易造成生物危险。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种方法稳定的提高乌鳢三倍体育成率的方法。为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌鳢人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为15～20g/kg饲料，待用；（2）投喂：在乌鳢母本产卵前5～10天，按常规饲料投喂方法对乌鳢母本进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g乌鳢母本投喂15～20g，下午6：00每100g乌鳢母本投喂10～15g；至其卵发育成熟，然后，取雄乌鳢放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用；（3）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤（2）中的受精卵放入温度为-1～1.0℃的冷水中，静水压压力为180～300Kg/cm2，持续时间为2～3min；（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为60～120mg/l，睾酮的浓度为20～80mg/l；（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10～30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗；（6）取步骤（5）中的鱼苗，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加10～15g氯米芬，每次投喂量为每万尾20～40g加有氯米芬的幼体料，每天投喂三次，直至变为乌仔苗；从而获得雄性乌鳢四倍体纯系；（7）三倍体的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。本专利技术的优点：1、本专利技术给母本饲喂他莫昔芬，起到抑制DNA复制和促雄性的双重作用的同时，将受精卵第一次卵裂时间推延3-5min，并提高了所有受精卵第一次卵裂的同步度（可达99%），为染色体加倍和提高其四倍体率提供了时间保障和奠定了坚实基础；2、在受精卵一次卵裂采用冷休克与较低的静水压（低于常用的350kg/cm2），以及较短的处理时间（低于5min），不仅有效降低了因为冷休克时间过长、压力过高对受精卵的破坏程度，提高受精卵的成活率，而且降低了操作难度和加压成本；3、雌激素抑制剂溶液浸泡以及投喂氯米芬幼体料，有效强化与保证雄性转化率；4、用纯系的雄性四倍体与原有的雌性二倍体回交，有效保证了三倍体的纯度。因而通过此方法，可获得100%的乌鳢三倍体纯系，提高了三倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选种的麻烦，更主要的是对自然水产品种种质和生态环境无污染。具体实施方式现结合具体实施例，对本专利技术作进一步描述。实施例一提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌鳢人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为15g/kg饲料，待用；（2）投喂：在乌鳢母本产卵前5天，按常规饲料投喂方法对乌鳢母本进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g乌鳢母本投喂20g，下午6：00每100g乌鳢母本投喂15g；至其卵发育成熟，然后，取雄乌鳢放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用；（3）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤（2）中的受精卵放入温度为0℃的冷水中，静水压压力为260Kg/cm2，持续时间为3min；（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为60mg/l，睾酮的浓度为20mg/l；（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗；（6）取步骤（5）中的鱼苗，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加15g，每次投喂量为每万尾40g，每天投喂三次，直至变为乌仔苗；从而获得雄性乌鳢四倍体纯系；（7）三倍体的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。实施例二提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌鳢人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为20g/kg饲料，待用；（2）投喂：在乌鳢母本产卵前10天，按常规饲料投喂方法对乌鳢母本进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g乌鳢母本投喂20g，下午6：00每100g乌鳢母本投喂10g；至其卵发育成熟，然后，取雄乌鳢放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用；（3）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤（2）中的受精卵放入温度为0℃的冷水中，静水压压力为300Kg/cm2，持续时间为3min；（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为100mg/l，睾酮的浓度为60mg/l；（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗；（6）取步骤（5）中的鱼苗，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加10g，每次投喂量为每万尾20g，每天投喂三次，直至变为乌仔苗；从而获得雄性乌鳢四倍体纯系；（7）三倍体的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。上述两个实施例仅为本专利技术的优选方案之二，并不能限制本专利技术的保护范围，任意与本专利技术等同或相似的技术手段视为本专利技术的保护范围。以下附上本专利技术部分处理方式及结果统计。附：乌鳢三倍体育成结果统计注：上述结果是在乌鳢母本产卵前10天投喂他莫昔芬，静水压处理3分钟、常温浸泡10s、每万尾投喂氯米芬0.2g所取得的结果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌鳢人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为15～20g/kg饲料，待用；（2）投喂：在乌鳢母本产卵前5～10天，按常规饲料投喂方法对乌鳢母本进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g乌鳢母本投喂15～20g，下午6：00每100g乌鳢母本投喂10～15g；至其卵发育成熟，然后，取雄乌鳢放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用；（3）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤（2）中的受精卵放入温度为‑1～1.0℃的冷水中，静水压压力为180～300Kg/cm2，持续时间为2～3min；（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为60～120mg/l，睾酮的浓度为20～80mg/l；（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10～30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗；（6）取步骤（5）中的鱼苗，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加10～15g氯米芬，每次投喂量为每万尾20～40g加有氯米芬的幼体料，每天投喂三次，直至变为乌仔苗；从而获得雄性乌鳢四倍体纯系；（7）三倍体的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。...

【技术特征摘要】
1.一种提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌鳢人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为15～20g/kg饲料，待用；（2）投喂：在乌鳢母本产卵前5～10天，按常规饲料投喂方法对乌鳢母本进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g乌鳢母本投喂15～20g，下午6：00每100g乌鳢母本投喂10～15g；至其卵发育成熟，然后，取雄乌鳢放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用；（3）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤（2）中的受精卵放入温度为-1～1.0℃的冷水中，静水压压力为180～300Kg/cm2，持续时间为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨品红，谢中国，王芙蓉，
申请(专利权)人：湖南文理学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43