一种人体口腔黏膜模型及其制备方法技术

本发明专利技术属于组织工程技术领域，具体涉及一种人体口腔黏膜模型及其制备方法，该黏膜模型包括基底层以及固有层之外，还包括上皮层，从而高度接近人体口腔黏膜的上皮组织的结构。该模型可以应用于口腔护理产品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品等产品的安全性与功效性检测及其他与口腔黏膜接触的材料的安全性与功效性评价，并且使得到的检测数据与评价结果更接近口腔黏膜的测评结果。

A human oral mucosa model and its preparation method

The invention belongs to the field of tissue engineering technology, in particular to a human oral mucosa model and its preparation method. The mucosa model comprises a basal layer and an inherent layer, as well as an epithelial layer, thus highly approaching the structure of human oral mucosa epithelial tissue. The model can be applied to the safety and efficacy testing of oral care products, small molecule compounds, active proteins, medical devices, chemicals, disposable sanitary products and other materials in contact with oral mucosa, and make the testing data and evaluation results closer to the evaluation results of oral mucosa.

【技术实现步骤摘要】
一种人体口腔黏膜模型及其制备方法
本专利技术属于组织工程
，具体涉及一种人体口腔黏膜模型及其制备方法。
技术介绍
2009年3月，欧盟化妆品法规(EC)1223/2009正式实施，已禁止化妆品、化学品等的动物实验。而传统的2D模型只能用于研究细胞迁移和增殖，无法用于口腔黏膜的功能、药物经皮吸收及病理学研究。与3D模型相比，2D模型的细胞行为表现有显著差异，在2D培养模型下筛选出的有效原料或产品用于临床疗效不理想。但是人体来源的口腔黏膜组织主要存在取材困难、来源有限，不能满足口腔相关产品体外评价数量需求。欧洲、美国、日本等世界发达地区或国家已成立动物实验替代机构旨在积极推动替代方法进行更为系统而深入的研究，目前已顺利完成相关技术储备，并通过立法程序建立起相应的技术性贸易措施体系。我国现也已有和国际接轨的相关法律法规，以体外替代试验方法取代传统的动物试验。GB/T16886-1《医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验》提到：只要科学上证明能获得与动物试验同样的信息，建议优先采用体外模式。在此背景下，以正常的人体口腔黏膜生理结构和功能为基础,利用组织工程原理和技术构建的3D口腔黏膜模型成为未来首选的生物学评价工具。正常的人体口腔黏膜生理结构包括固有层和上皮层，其中，上皮层为复层鳞状上皮，主要由角质细胞构成，此外还有少数非角质细胞。固有层由致密的结缔组织组成。固有层的基本细胞成分是成纤维细胞，有合成和更新纤维及基质的功能。固有层的纤维主要是Ⅰ型胶原纤维。现有技术的组织工程口腔黏膜模型只构建了口腔黏膜上皮层，并且以口腔黏膜鳞状癌细胞为种子细胞。因此现有技术模型构建而成的结构不能很好的反映人天然口腔黏膜结构。例如，专利CN105255833A公开了一种口腔黏膜上皮模型及其体外构建方法，使用口腔黏膜鳞状癌细胞经体外扩增后，采用气液面培养法，使其复层化，形成体外口腔黏膜上皮模型。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种人体口腔黏膜模型及其制备方法，构建与人体口腔黏膜上皮组织的结构及功能高度相似的体外口腔黏膜上皮模型。为了达到上述技术目的，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术提供一种人体口腔黏膜模型，包括自下而上排列的基底层、固有层和上皮层，所述固有层包括口腔成纤维细胞和生物支架材料，所述上皮层包括口腔上皮细胞。优选地，所述基底层包括支撑膜，所述支撑膜所使用的材料可以是尼龙膜、硅胶膜、橡胶膜或合成高分子材料膜。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的制备方法中所用的支撑膜为合成高分子材料膜，PE膜或PET膜。优选地，所述口腔成纤维细胞的来源不受本专利技术的限制，可以为可向成纤维细胞分化的干细胞，也可以为口腔组织分离培养的原代细胞，也可为商业化的永生口腔成纤维细胞。优选地，所述生物支架材料的来源不受本专利技术的限制，可以为胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、多糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物中的一种或两者以上混合物。优选地，所述口腔上皮细胞包括口腔角质细胞，其来源不受本专利技术的限制，可以为可向角质细胞分化的干细胞，也可以为口腔组织分离培养的原代细胞，也可为商业化的永生口腔角质细胞。优选地，所述成纤维细胞复合于生物支架材料内部，使生物支架材料模拟细胞外基质的作用，在细胞之间形成适宜的空间分布和细胞联系，从而更加接近人体的口腔黏膜固有层。与现有技术相比，本专利技术提供的人体口腔黏膜模型包括基底层以及固有层之外，还包括上皮层，从而高度接近人体口腔黏膜的上皮组织的结构。由于将成纤维细胞复合于生物支架材料内部，使生物支架材料模拟细胞外基质的作用，在细胞之间形成适宜的空间分布和细胞联系，并且使上皮细胞在固有层表面接种，通过气液面培养法使上皮细胞复层化，使该模型接近人体口腔黏膜的上皮组织的结构和功能。因此，该模型可以应用于口腔护理产品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品等产品的安全性与功效性检测及其他与口腔黏膜接触的材料的安全性与功效性评价，并且使得到的检测数据与评价结果更接近口腔黏膜的测评结果。在体外条件下该模型的功能和活性维持时间，能够满足相关口腔黏膜生物学检测的需求。本专利技术还提供了一种人体口腔黏膜模型的制备方法，其包括如下步骤:(1)口腔上皮细胞和成纤维细胞的培养；(2)基底层的配置：取DMEM培养基、牛血清、生物支架材料混合，调节pH值至pH7.0-pH7.6后，置于支撑膜上，固化；(3)固有层的配置：取DMEM培养基、牛血清、生物支架材料混合，调节pH值至pH7.0-pH7.4后，加入成纤维细胞，置于所述基底层之上，固化之后，加入成纤维培养基，培养4-7天；(4)上皮层的配置：取上皮细胞平铺于所述固有层，孵育0.5h-3h，加入上皮培养基，培养1-3天；(5)全层口腔黏膜的形成和成熟：将上皮培养基舍弃，进行气液界面培养5-14天。本专利技术的制备方法，上皮层的配置中上皮细胞的添加量为5×105-5×107个/mL。本专利技术提供的制备方法中，固有层的配置中成纤维细胞的添加量为1×105-1×107个/mL。本专利技术提供的制备方法中，上皮层和固有层的配置中上皮和成纤维细胞培养基包括以下含量的各个组分：本专利技术提供的制备方法中，全层口腔黏膜的成熟中，所述气液界面培养的培养基包括以下含量的各个组分：附图说明图1是实施例2的人体口腔黏膜模型在20倍镜下显微镜图；图2是实施例2的人体口腔黏膜模型200倍镜下显微镜图；图3是实施例2的人体口腔黏膜模型400倍镜下显微镜图；图4是实施例2的人体口腔黏膜模型与对照组分别进行紫外光谱测试的柱形图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例详细说明本专利技术的技术方案。实施例1一种人体口腔黏膜模型，包括自下而上排列的基底层、固有层和上皮层，所述固有层包括口腔成纤维细胞和生物支架材料，所述上皮层包括口腔上皮细胞。所述基底层包括支撑膜，所述支撑膜所使用的材料可以是尼龙膜、硅胶膜、橡胶膜或合成高分子材料膜。例如，所用的支撑膜为合成高分子材料膜，PE膜或PET膜。所述口腔成纤维细胞的来源不受本专利技术的限制，可以为可向成纤维细胞分化的干细胞，也可以为口腔组织分离培养的原代细胞，也可为商业化的永生口腔成纤维细胞。所述生物支架材料的来源不受本专利技术的限制，可以为胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、多糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物中的一种或两者以上混合物。所述口腔上皮细胞包括口腔角质细胞，其来源不受本专利技术的限制，可以为可向角质细胞分化的干细胞，也可以为口腔组织分离培养的原代细胞，也可为商业化的永生口腔角质细胞。所述成纤维细胞复合于生物支架材料内部，使生物支架材料模拟细胞外基质的作用，在细胞之间形成适宜的空间分布和细胞联系，从而更加接近人体的口腔黏膜固有层。本实施例1提供的人体口腔黏膜模型包括基底层以及固有层之外，还包括上皮层，从而高度接近人体口腔黏膜的上皮组织的结构。由于将成纤维细胞复合于生物支架材料内部，使生物支架材料模拟细胞外基质的作用，在细胞之间形成适宜的空间分布和细胞联系，并且使上皮细胞在固有层表面接种，通过气液面培养法使上皮细胞复层化，使该模型接近人体口腔黏膜的上皮组织的结构和功能。因此，该模型可以应用于口腔护理产品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人体口腔黏膜模型，其特征在于，包括自下而上排列的基底层、固有层和上皮层，所述固有层包括口腔成纤维细胞和生物支架材料，所述上皮层包括口腔上皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人体口腔黏膜模型，其特征在于，包括自下而上排列的基底层、固有层和上皮层，所述固有层包括口腔成纤维细胞和生物支架材料，所述上皮层包括口腔上皮细胞。2.根据权利要求1所述的人体口腔黏膜模型，其特征在于，所述基底层包括支撑膜，所述支撑膜所使用的材料是尼龙膜、硅胶膜、橡胶膜或合成高分子材料膜。3.根据权利要求1所述的人体口腔黏膜模型，其特征在于，所述口腔成纤维细胞为可向成纤维细胞分化的干细胞或口腔组织分离培养的原代细胞或商业化的永生口腔成纤维细胞；所述生物支架材料的来源为胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、多糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物中的一种或两者以上混合物；所述口腔上皮细胞包括口腔角质细胞，其来源为可向角质细胞分化的干细胞或口腔组织分离培养的原代细胞或商业化的永生口腔角质细胞。4.根据权利要求1所述的人体口腔黏膜模型，其特征在于，所述成纤维细胞复合于生物支架材料内部。5.一种人体口腔黏膜模型的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)口腔上皮细胞和成纤维细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏珊，李平，李林，王真史，
申请(专利权)人：广州薇美姿实业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44