腺相关病毒(AAV)进化枝F载体及其用途制造技术

一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含在生产系统中产生的AAVhu68衣壳，所述生产系统包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与其具有至少75％同一性的序列，其编码SEQ ID NO:2。AAVhu68衣壳包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的天冬酰胺‑甘氨酸对中高度脱酰胺的天冬酰胺残基的亚群。还提供了含有所述rAAV的组合物及其用途。另外，提供了具有工程化AAV衣壳的rAAV，所述工程化AAV衣壳包含参考所述AAVhu68 vp1编号具有氨基酸位置157处的Val的vp1或vp2蛋白的至少一个亚群。

Adeno-associated virus (AAV) evolution branch f vector and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺相关病毒(AAV)进化枝F载体及其用途关于联邦政府资助的研究或开发的声明本申请包含国防高级研究计划局(DefenseAdvancedResearchProjectsAgency，DARPA)在W911NF-13-2-0036下支持的工作。美国政府可拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
腺病毒相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvovirus)的成员，是一种小的无包膜二十面体病毒，具有约4.7千碱基(kb)长的单链线性DNA(ssDNA)基因组。野生型基因组包含在DNA链两端的反向末端重复(ITR)和两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。Rep由编码AAV生命周期所需的rep蛋白的四个重叠基因组成，并且cap包含衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠核苷酸序列，VP1、VP2和VP3自组装形成二十面体对称的衣壳。AAV被分配到依赖性病毒(Dependovirus)属，因为该病毒被发现是纯化的腺病毒原种中的污染物。AAV的生命周期包括潜伏期，在此阶段AAV基因组在感染后特异性整合到宿主染色体中，以及感染期，在此阶段在腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组随后被拯救、复制并包装成感染性病毒。非致病性、感染性的广泛宿主范围(包括非分裂细胞)、和潜在的位点特异性染色体整合的特性使AAV成为基因转移的有吸引力的工具。已经将来自复制缺陷型人细小病毒的重组腺相关病毒(rAAV)载体描述为用于基因递送的合适载体。通常，从载体中除去功能性rep基因和cap基因，产生无复制能力的载体。这些功能在载体生产系统中提供，但在最终载体中不存在。迄今为止，已经有从人或非人灵长类动物(NHP)分离的多种不同的充分表征的AAV。已经发现，不同血清型的AAV表现出不同的转染效率，并且表现出对不同细胞或组织的向性。WO2005/033321中描述了许多不同的AAV进化枝，包括进化枝F，其在其中被鉴定为仅具有三个成员AAV9、AAVhu31和AAVhu32。AAV9的结构分析在M.A.DiMattia等人,J.Virol.(2012年6月)vol.86no.126947-6958中。该文献报道了AAV9具有三种可变蛋白(vp)的60个拷贝(总共)，所述可变蛋白(vp)由cap基因编码并具有重叠序列。这些包括VP1(87kDa)、VP2(73kDa)和VP3(62kDa)，它们分别以1:1:10的预测比率存在。VP3的整个序列在VP2内，并且VP2整个在VP1内。VP1具有独特的N末端结构域。精细坐标(refinedcoordinate)和结构因素可在RCSBPDB数据库的登录号3UX1下获得。已经设计了多种不同的AAV9变体以去靶向(detarget)或靶向不同的组织。参见，例如，N.Pulicheria,"EngineeringLiver-detargetedAAV9VectorsforCardiacandMusculoskeletalGeneTransfer",MolecularTherapy,Vol,19,no.6,p.1070-1078(2011年6月)。还报道了递送基因穿过血脑屏障的AAV9变体的开发。参见例如B.E.Deverman等人,NatureBiotech,Vol.34,No.2,p204-211(2016年2月1日在线发布)和Caltechpressrelease,A.Wetherston,www.neurology-central.com/2016/02/10/successful-delivery-of-genes-through-the-blood-brain-barrier/,accessed10/05/2016。还参见WO2016/0492301和US8,734,809。期望的是用于递送异源分子的基于AAV的构建体。
技术实现思路
描述了新的AAVhu68衣壳和rep序列，其用于制备和用于将核酸分子递送至宿主细胞的载体。在某些实施方案中，提供了具有AAVhu68衣壳的重组AAV，所述AAVhu68衣壳由SEQIDNO:1的核酸序列或与编码SEQIDNO:2的氨基酸序列的SEQIDNO:1具有至少70％同一性，与SEQIDNO:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的核酸序列编码。在一个实施方案中，提供了重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV68衣壳，所述AAV68衣壳包含以下的一种或多种：(1)AAVhu68衣壳蛋白，其包含：自由编码SEQIDNO:2的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68vp1蛋白，由SEQIDNO:1产生的vp1蛋白，或者由与编码SEQIDNO:2的1至736的预测氨基酸序列的SEQIDNO:1具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白，由编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68vp2蛋白，由包含SEQIDNO:1的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或者由与编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQIDNO:1的至少核苷酸412至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白，由编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68vp3蛋白，由包含SEQIDNO:1的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或者由与编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQIDNO:1的至少核苷酸607至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白；和/或(2)AAV衣壳蛋白，其包含：基于SEQIDNO:2的vp1衣壳的编号，任选地包含位置157处的缬氨酸和/或位置67处的谷氨酸的vp1蛋白的异质群、任选地包含位置157处的缬氨酸的vp2蛋白的异质群、和vp3蛋白的异质群，其中至少vp1和vp2亚群包含位置157处的缬氨酸，并且任选地还包含位置67处的谷氨酸；和/或(3)为编码SEQIDNO:2的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群，为编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群，和为编码SEQIDNO:2的至少氨基酸203至736的氨基酸的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群，其中：vp1、vp2和vp3蛋白包含具有氨基酸修饰的亚群，该亚群包含SEQIDNO:2的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)，并且任选地还包含含有其他脱酰胺氨基酸的亚群，其中所述脱酰胺导致氨基酸改变；以及(B)所述AAVhu68衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包含核酸分子，所述核酸分子包含AAV反向末端重复序列和编码产物的非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列与指导产物在宿主细胞中表达的序列可操作地连接。例如，四个残基(N57、N329、N452、N512)通常显示高水平的脱酰胺。其他残基(N94、N253、N270、N304、N4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：/n(A)AAV68衣壳，所述AAV68衣壳包含以下的一种或多种：/n(1)AAVhu68衣壳蛋白，其包含：/nAAVhu68 vp1蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp1蛋白选自：由编码SEQ ID NO:2的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的vp1蛋白，由SEQ ID NO:1产生的vp1蛋白，或者由与编码SEQ ID NO:2的1至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白，/nAAVhu68 vp2蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp2蛋白选自：由编码SEQ ID NO:2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO:1的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或者由与编码SEQ ID NO:2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:1的至少核苷酸412至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白，/nAAVhu68 vp3蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp3蛋白选自：由编码SEQ ID NO:2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的vp3，由包含SEQ ID NO:1的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或者由与编码SEQ ID NO:2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:1的至少核苷酸607至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白；和/或/n(2)AAV衣壳蛋白，其包含：vp1蛋白的异质群、任选地包含位置157处的缬氨酸的vp2蛋白的异质群，和vp3蛋白的异质群，其中基于SEQ ID NO:2的vp1衣壳的编号，至少vp1和vp2蛋白的亚群包含位置157处的缬氨酸，并且任选地还包含位置67处的谷氨酸；和/或/n(3)为编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群，为编码SEQ ID NO:2的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群，和为编码SEQ ID NO:2的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群，其中：vp1、vp2和vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群，所述亚群包含SEQ ID NO:2的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)，并且任选地还包含含有其他脱酰胺氨基酸的亚群，其中所述脱酰胺导致氨基酸改变；以及/n(B)所述AAVhu68衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包含核酸分子，所述核酸分子包含AAV反向末端重复序列和编码产物的非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列与指导所述产物在宿主细胞中表达的序列可操作地连接。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170228 US 62/464748;20171127 US 62/591002;2018011.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：
(A)AAV68衣壳，所述AAV68衣壳包含以下的一种或多种：
(1)AAVhu68衣壳蛋白，其包含：
AAVhu68vp1蛋白的异质群，所述AAVhu68vp1蛋白选自：由编码SEQIDNO:2的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的vp1蛋白，由SEQIDNO:1产生的vp1蛋白，或者由与编码SEQIDNO:2的1至736的预测氨基酸序列的SEQIDNO:1具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白，
AAVhu68vp2蛋白的异质群，所述AAVhu68vp2蛋白选自：由编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的vp2蛋白，由包含SEQIDNO:1的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或者由与编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQIDNO:1的至少核苷酸412至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白，
AAVhu68vp3蛋白的异质群，所述AAVhu68vp3蛋白选自：由编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的vp3，由包含SEQIDNO:1的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或者由与编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQIDNO:1的至少核苷酸607至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白；和/或
(2)AAV衣壳蛋白，其包含：vp1蛋白的异质群、任选地包含位置157处的缬氨酸的vp2蛋白的异质群，和vp3蛋白的异质群，其中基于SEQIDNO:2的vp1衣壳的编号，至少vp1和vp2蛋白的亚群包含位置157处的缬氨酸，并且任选地还包含位置67处的谷氨酸；和/或
(3)为编码SEQIDNO:2的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群，为编码SEQIDNO:2的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群，和为编码SEQIDNO:2的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群，其中：vp1、vp2和vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群，所述亚群包含SEQIDNO:2的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)，并且任选地还包含含有其他脱酰胺氨基酸的亚群，其中所述脱酰胺导致氨基酸改变；以及
(B)所述AAVhu68衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包含核酸分子，所述核酸分子包含AAV反向末端重复序列和编码产物的非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列与指导所述产物在宿主细胞中表达的序列可操作地连接。


2.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述脱酰胺的天冬酰胺被脱酰胺为天冬氨酸、异天冬氨酸、互变天冬氨酸/异天冬氨酸对、或其组合。


3.根据权利要求1或2所述的rAAV，其中所述衣壳还包含脱酰胺的谷氨酰胺，所述脱酰胺的谷氨酰胺被脱酰胺为(α)-谷氨酸、γ-谷氨酸、互变(α)-谷氨酸/γ-谷氨酸对、或其组合。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的rAAV，其中所述AAVhu68衣壳包含具有以下的一种或多种的亚群：
(a)基于SEQIDNO:2的编号，位于vp1蛋白的位置57处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少65％的天冬酰胺(N)被脱酰胺；
(b)基于SEQIDNO:2的氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白的位置329的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少75％的N被脱酰胺，
(c)基于SEQIDNO:2的氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白的位置452的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少50％的N被脱酰胺；和/或
(d)基于SEQIDNO:2的氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白的位置512的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少75％的N被脱酰胺。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的rAAV，其中所述rAAVhu68衣壳包含vp1的亚群，其中如使用质谱法测定的，vp1蛋白的位置57处的75％至100％的N被脱酰胺。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的rAAV，其中所述rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中如使用质谱法测定的，基于SEQIDNO:2的编号，位置329处的75％至100％的N被脱酰胺。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的rAAV，其中所述rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中如使用质谱法测定的，基于SEQIDNO:2的编号，位置452处的75％至100％的N被脱酰胺。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的rAAV，其中所述rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于SEQIDNO:2的编号，位置512处的75％至100％的N被脱酰胺。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的rAAV，其中编码所述蛋白质的核酸序列是SEQIDNO:1，或与编码SEQIDNO:2的氨基酸序列的SEQIDNO:1具有至少80％至至少99％同一性的序列。


10.根据权利要求9所述的rAAV，其中所述核酸序列与SEQIDNO:1具有至少80％至97％同一性。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的rAAV，其中所述rAAVhu68衣壳还至少包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，所述亚群具有从SEQIDNO:2的氨基酸修饰，其在选自以下的至少四个位置处包含至少约50％至100％的脱酰胺：N57、329、452、512的一个或多个，或其组合。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的rAAV，其中所述rAAVhu68衣壳包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，所述亚群还在以下的至少一个或多个位置处包含1％至约40％的脱酰胺：N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N336、N409、N410、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N7...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM威尔逊，王强，A吉尔斯，K特纳，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州大学信托人，
类型：发明
国别省市：美国;US