一种快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法，所述方法是以传染性支气管炎病毒H120疫苗株的感染性克隆为骨架载体，再将骨架载体中的抗原基因置换为传染性支气管炎流行毒株的目的抗原基因，从而获得重组支气管炎病毒的方法，所述目的抗原基因是不同血清型/基因型的传染性支气管炎流行毒株的S基因片段嵌合而成；所述置换还可以是目的抗原基因与N基因同时置换，置换时均需保留骨架载体中原有的S1基因的信号肽区域。其有益效果在于，本发明专利技术所述快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法，操作方法简单易行，重复性高，传代稳定性好，能快速高效的应对频繁变异的IBV流行，并且所述方法为载体疫苗的构建提供新思路。

A method of rapid preparation of infectious bronchitis vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法
本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法。
技术介绍
禽传染性支气管炎(Infectiousbronchitis，IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触传染性疾病，是国际兽医局(OIE)及我国规定的家禽B/二类传染病之一，以呼吸道症状、肾炎和生产性能下降为特征，尤其是肉鸡发生以肾肿为特征的肾型传支后造成高死亡率，白羽肉鸡死淘率可达到30％以上，优质肉鸡可造成15％左右的死亡率，发病肉鸡的增重和饲料报酬降低，与大肠杆菌、支原体等混合感染引发气囊炎使肉鸡品质下降。蛋雏鸡感染IB，除可引起死亡外，还会造成生殖系统永久非可逆损伤，表现为输卵管和卵巢发育不良，或输卵管、子宫大量积水囊肿，造成假母鸡，表现为无产蛋高峰，产蛋数量与产蛋质量下降、产白壳蛋、软壳蛋、纱皮蛋和崎形蛋。部分IBV毒株还可以引起肠道、腺胃、肌肉的病变。IB对各个日龄、各个品种鸡群都可造成危害，给全球养禽业造成巨大的经济损失，是严重影响世界养禽业的重大传染病之一。目前，禽传染性支气管炎的防控主要以疫苗为主，市场上疫苗主要分为：1)灭活苗：灭活疫苗不能在体内复制，所以它们不可能毒力反强并导致病理损伤，诱导的免疫应答持续期较短，并且仅诱导抗体产生，而不能介导T细胞的免疫应答。因此，使用灭活疫苗免疫时需要大剂量的佐剂和多次疫苗接种，这可能增加疫苗生产成本，从而限制了它们的推广应用。灭活疫苗必须注射接种，这种方式在大规模养禽环境中难以实施甚至是不可行的。同样，注射部位的不良反应问题也可能导致胴体价值降低。2)弱毒活苗：制备过程费时费力；存在体内突变、重组、毒力反强风险；母源抗体中和，降低疫苗应答重组DNA疫苗，某些需要有效的载体递送；制备时技术严苛；翻译后蛋白修饰可能改变蛋白免疫原性。但20世纪90年代以来，IB仍然在国内相继爆发，且流行十分广泛，给养禽业带来巨大经济损失。原因在于IBV在宿主细胞内复制的过程中，由于RNA聚合酶(RDRP)缺乏校对功能和低保真性，其基因组在复制过程中十分容易发生点突变、插入和缺失，特别是S1基因上点突变很可能造成中和抗原位点的改变，导致新的血清型、基因型的产生。因此IBV防控的难点在于血清型、基因型众多，且不同血清型、基因型间没有交叉保护或者交叉保护很弱。
技术实现思路
本专利技术克服了传统弱毒疫苗研制过程中需要耗时耗力分离纯化病毒、连续传代致弱病毒存在不确定以及田间应用时毒力返强等问题，避免了成本高、生产周期长以及有可能污染外源病毒等缺点，提供一种针对流行传染性支气管炎的时效性强、拯救效率高，且快速制备重组病毒疫苗的方法，所述方法是以传染性支气管炎病毒H120疫苗株的感染性克隆为骨架载体，再将骨架载体中的抗原基因置换为传染性支气管炎流行毒株的目的抗原基因，从而获得重组支气管炎病毒的方法，所述目的抗原基因为S基因或S1基因，所述S基因是不同血清型/基因型的传染性支气管炎流行毒株的S基因片段嵌合而成，所述置换时需保留骨架载体中原有的S1基因的信号肽区域。由IBVS基因编码的S蛋白是高度糖基化的跨膜蛋白，位于病毒表面，含有IBV的主要抗原中和表位，可以刺激机体产生特异性中和抗体。S基因翻译后被切割成S1蛋白和S2蛋白两部分，S1蛋白在氨基末端，是病毒最重要的免疫原成分之一，含有诱导产生中和抗体的抗原表位，并且通过病毒与细胞之间的相互作用而发生受体结合。且S1蛋白与毒株的组织亲和性及毒力有关，其N端决定着IBV的血清型差异。S1基因的变异与IBV的抗原漂移和致病性改变密切相关。本专利技术中，目的抗原基因S基因来自不同血清型/基因型传染性支气管炎流行毒株的S基因片段嵌合而成，不仅使得到重组病毒拥有更高的抗体滴度，更提供了一种新的置换方式，为多血清型/基因型IB疫苗提供更多可能性。并且专利技术人在置换时分别采用保留或不保留骨架载体中原有的S1基因的信号肽区域的两组对照实验中发现保留骨架载体中原有的S1基因的信号肽区域，是成功拯救获得重组病毒的关键因素。进一步，基于本专利技术的一个实施例，所述嵌合为一种血清型/基因型的传染性支气管炎流行毒株的S1基因与另一种血清型/基因型的传染性支气管炎流行毒株的S2基因嵌合，形成一个有两种血清型/基因型的嵌合S基因。S2基因编码的S2蛋白在大多数IBV毒株中非常保守，除具有将锚定S1蛋白作用外，还具有诱导产生细胞介导的免疫应答和交叉反应ELISA抗体的功能。进一步，所述S2基因来源于传染性支气管炎流行毒株或传染性支气管炎疫苗毒株。本研究发现S2基因的来源不限于传染性支气管炎流行毒株，使用安全性较好的疫苗毒亦可使嵌合基因带有对疫苗毒株所属基因型、血清型的传染性支气管炎病毒的免疫原性，从而刺激机体产生对应的抗体。进一步，所述S1基因是包含有高变区的S1片段。S1蛋白氨基酸序列存在高变区(HVR)，HVR构成了IBV的血清型、基因型特异性抗原决定簇，HVR的突变可能影响病毒亚群的状况，并导致具有不同致病性和毒力的新变异株出现，与免疫保护相关性强，因此，只有置换的区域包含HVR，才能特异性的刺激机体的免疫反应，产生针对于该种亚型的IB抗体。进一步，所述方法包括以下步骤：A1：分离得到不同血清型强致病性的传染性支气管炎流行野毒株两株，分别提取RNA并反转录为cDNA，以各自cDNA为模板扩增分别得到对应的S21基因，S22基因以及不包括信号肽区域的S11基因和S12基因；A2：将步骤A1中的S11基因和S22基因嵌合或步骤A1中的S12基因和S21基因嵌合，得到嵌合基因S11+S22或S12+S21；A3：利用RED/ET技术将步骤A2中的嵌合基因S11+S22或S12+S21置换到构建好的H120感染性克隆的载体骨架上，筛选得到阳性重组质粒；A4：再将步骤A3中的重组质粒拯救，得到能免疫步骤A1中两种血清型的传染性支气管炎病毒的重组病毒。进一步，步骤A3中，所述嵌合基因S11+S22为GL15的S1基因+GZ14的S2基因，其中GL15序列的GenBank登录号为：KJ524616，GZ14序列的GenBank登录号为：KT946798。GL15和GZ14均为前期所获的传染性支气管炎的致病性强毒株，其基因序列已经公布，采用GL15的S1基因+GZ14的S2基因所嵌合成的S基因用于置换H120株中对应的S1和N基因，是作为本专利技术的一个实施例，但并不限于这两种毒株。本专利技术还提供另一种快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法，还是以传染性支气管炎病毒H120疫苗株的感染性克隆为骨架载体，再将骨架载体中的抗原基因置换为传染性支气管炎流行毒株的目的抗原基因，从而获得重组支气管炎病毒的方法，不同的是，所述置换为目的抗原基因与N基因同时置换，所述目的抗原基因为S基因或S1基因，所述置换时需保留骨架载体中原有的S1基因的信号肽区域。N基因锁编码本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法，其特征在于，所述方法是以传染性支气管炎病毒H120疫苗株的感染性克隆为骨架载体，再将骨架载体中的抗原基因置换为传染性支气管炎流行毒株的目的抗原基因，从而获得重组支气管炎病毒的方法，所述目的抗原基因为S基因或S1基因，所述S基因是不同血清型/基因型的传染性支气管炎流行毒株的S基因片段嵌合而成，所述置换时需保留骨架载体中原有的S1基因的信号肽区域。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法，其特征在于，所述方法是以传染性支气管炎病毒H120疫苗株的感染性克隆为骨架载体，再将骨架载体中的抗原基因置换为传染性支气管炎流行毒株的目的抗原基因，从而获得重组支气管炎病毒的方法，所述目的抗原基因为S基因或S1基因，所述S基因是不同血清型/基因型的传染性支气管炎流行毒株的S基因片段嵌合而成，所述置换时需保留骨架载体中原有的S1基因的信号肽区域。


2.根据权利要求1所述快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法，其特征在于，所述嵌合为一种血清型的传染性支气管炎流行毒株的S1基因与另一种血清型/基因型的传染性支气管炎毒株的S2基因嵌合，形成一个有两种血清型/基因型的嵌合S基因。


3.根据权利要求2所述快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法，其特征在于，所述S2基因来源于传染性支气管炎流行毒株或传染性支气管炎疫苗毒株。


4.根据权利要求1或2所述快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法，其特征在于，所述S1基因是包含有高变区的S1片段。


5.根据权利要求1～4任意一项所述快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A1：分离得到不同血清型/基因型强致病性的传染性支气管炎流行野毒株两株，分别提取RNA并反转录为cDNA，以各自cDNA为模板扩增分别得到对应的S21基因，S22基因以及不包括信号肽区域的S11基因和S12基因；
A2：将步骤A1中的S11基因和S22基因嵌合或步骤A1中的S12基因和S21基因嵌合，得到嵌合基因S11+S22或S...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢青梅，封柯宇，符军，邵冠明，张新珩，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44