本发明专利技术提供一种表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株的VP2基因重组火鸡疱疹病毒株，是在火鸡疱疹病毒基因组中插入IBDV VP2基因外源制备的。本发明专利技术以火鸡疱疹病毒(HVT)FC‑126疫苗毒株为载体，以其UL45‑UL46的间隔区为插入位点，将含有VP2基因的表达盒插入到火鸡疱疹病毒基因组中，获得重组病毒rHVT‑vVP2株。免疫保护评价结果表明本发明专利技术的rHVT‑vVP2株免疫鸡群后，针对IBDV强毒株及变异毒株的攻击，可以提供100％攻毒保护。
【技术实现步骤摘要】
一种表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒株
本专利技术属于分子生物学和基因工程疫苗
，具体涉及一种表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒株，该重组病毒免疫家禽可用于鸡传染性法氏囊病病毒的预防。
技术介绍
马立克氏病(Marek’sdisease，MD)和鸡传染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease,IBD)是常见的两种影响家禽生产性能的免疫抑制病。20世纪60年代，火鸡疱疹病毒(herpesvirusofturkey,HVT)FC-126株曾被作为疫苗用于控制MD的发生，在全球范围内都得到了广泛应用，大大降低了MD致病所带来的经济损失。随着MDV毒力的增强，原有疫苗己经不能对其进行有效防控，新的更加有效的疫苗被不断地研发出来，但HVT疫苗仍得到广泛的使用，特别是与其他疫苗联合使用，显示出很好的协同效果。而IBD是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)引起的禽类急性、高度接触性免疫抑制性传染病，该病主要感染3周龄～12周龄青年鸡，可通过导致鸡法氏囊损伤、引起免疫抑制和雏鸡死亡等对家禽养殖造成巨大的经济损失。目前IBDV超强毒株(vvIBDV)和变异株的出现给该病的防控带来巨大难度。IBD的免疫预防已成为目前防控该病的主要措施，目前商品化的传染性法氏囊病活疫苗分为弱毒、中等毒力和强毒三类。弱毒活疫苗对有母源抗体鸡群的免疫保护效果不理想。与弱毒疫苗相比，中等毒力和强毒疫苗的免疫保护力虽然高很多，但由于其具有一定的致病性，对法氏囊有一定的损伤。同时，由于受母源抗体干扰及IBDV的特点，导致传统疫苗在实际应用中形成不可避免的免疫空白期。因此，针对传染性法氏囊病新型疫苗研发重组活载体疫苗研究就成为目前的热点之一。影响外源基因表达水平的因素有很多，例如启动子的选择、密码子的偏嗜性、表达抗原的类型以及调控元件的作用等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种表达IBDV田间分离株的VP2基因重组火鸡疱疹病毒株，该病毒株可用于家禽中诱导针对IBDV的保护性免疫应答。本专利技术首先提供一种在火鸡疱疹病毒(HVT)基因组中插入外源基因的方法，是将外源基因插入火鸡疱疹病毒基因组的UL45区和UL46区的间隔区。更具体的，所述的插入位点位于HVT基因组UL45-UL46间隔区的95332nt-95342nt之间。本专利技术再一方面提供一种重组火鸡疱疹病毒，是通过在火鸡疱疹病毒的UL45-UL46间隔区插入表达IBDVVP2基因的表达盒所构建；所述的VP2基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1；其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:2。所述的表达IBDV田间分离株VP2基因的表达盒，依次包括mcmv启动子(鼠疱疹病毒Ⅰ型立即早期启动子)、VP2基因、单纯疱疹病毒TK基因聚腺苷酸化终止信号TKpolyA；其中由mcmv负责VP2基因的起始转录，TkployA终止子为VP2基因mRNA转录提供终止信号，同时mRNA3’端添加polyA尾巴。所述的表达IBDV田间分离株VP2基因的表达盒，其一种具体的核苷酸序列为SEQIDNO:3。所提供的重组火鸡疱疹病毒，其一种为重组火鸡疱疹病毒rHVT-vVP2株，于2019年10月15日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201967。本专利技术的rHVT-vVP2株用于表达田间分离株IBDV的VP2蛋白，本专利技术的rHVT-vVP2株的另一方面的用途是用于制备疫苗。本专利技术以火鸡疱疹病毒(HVT)FC-126疫苗毒株为载体，以其UL45-UL46的间隔区为插入位点，将含有VP2基因的表达盒插入到火鸡疱疹病毒基因组中，获得重组病毒rHVT-vVP2株。免疫保护评价结果表明本专利技术的rHVT-vVP2株免疫鸡群后，针对IBDV强毒株及变异毒株的攻击，可以提供100％攻毒保护。附图说明图1：转移的构建模式图；图2：重组病毒rHVT-vVP2的构建示意图；图3：VP2基因及其表达盒PCR电泳图；图4：转移载体pFR-EGFP转染DF1的荧光图；图5：Western-Blot试验鉴定转移载体pFR-VP2的蛋白表达；图6：重组病毒rHVT-EGFP的荧光图；图7：PCR鉴定重组病毒rHVT-vVP2图8：Western-Blot试验鉴定重组病毒rHVT-vVP2中VP2蛋白的表达图9：IFA鉴定重组病毒rHVT-vVP2。具体实施方式本专利技术首先利用同源重组原理，以HVT基因组的UL45-UL46间隔区、US2区、US10区为插入位点，分别构建在上述位点插入EGFP表达盒的重组病毒rHVT-EGFP，rHVT-US2-EGFP，rHVT-US10-EGFP。本专利技术选择田间分离的IBDV完整的VP2基因，在VP2基因上游串联mcmv启动子序列，VP2基因下游串联TKployA终止信号，构建含mcmv-VP2-TKpolyA的基因表达盒，分别以HVT基因组的UL45-UL46间隔区、US2区、US10区为插入位点，将上述表达盒分别连接到对应的含同源臂转移载体中，构建表达VP2基因的转移载体质粒(如图1所示)。再次，用上述转移载体质粒分别替换重组病毒rHVT-EGFP、rHVT-US2-EGFP，rHVT-US10-EGFP的标记基因EGFP，筛选出表达VP2基因重组病毒rHVT-vVP2、rHVT-US2-vVP2、rHVT-US10-vVP2(如图2所示)。IBDV的VP2蛋白是主要的免疫保护性抗原，针对VP2蛋白的中和抗体可抵御IBDV强毒株的攻击，因此构建表达IBDVVP2基因的重组活载体疫苗具有潜在的应用价值下面以构建rHVT-vVP2为例，对本专利技术进行详细的描述。实施例11实验材料1.1毒株、菌株和质粒HVTFC-126疫苗株由青岛易邦生物工程有限公司保存。IBDV由青岛易邦生物工程有限公司在田间分离获得。感受态细胞Trans-T1购自北京全式金生物技术有限公司；鸡胚成纤维细胞系(DF-1)由青岛易邦生物工程有限公司保藏。质粒：pEASY-T3，pEASY-Blunt，pEASY-M1购自北京全式金生物科技有限公司；PCR2.1、pT-EGFP由青岛易邦生物工程有限公司保存，其中pT-EGFP包含表达绿色荧光蛋白(GFP)的表达盒，表达盒两端分别有NotⅠ和AvrⅡ酶切位点。2实验方法2.1中间转移载体pFR的构建2.1.1同源臂引物的设计选择HVT的UL45-UL46间隔区插入外源基因，参照GenBank中登录的HVTFC126株(登录号：AF291866)的全基因序列，用PrimerPremier5.0引物设计软件设计两对引物，分别PCR扩增Fwd、Rev同源臂。F本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种在火鸡疱疹病毒基因组中插入外源基因的方法，其特征在于，所述的方法是将外源基因插入火鸡疱疹病毒基因组的UL45区和UL46区的间隔区。/n
【技术特征摘要】
1.一种在火鸡疱疹病毒基因组中插入外源基因的方法，其特征在于，所述的方法是将外源基因插入火鸡疱疹病毒基因组的UL45区和UL46区的间隔区。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的插入位点位于火鸡疱疹病毒HVT基因组UL45-UL46间隔区的95332nt-95342nt之间。
3.如如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源基因为鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因。
4.一种重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述的重组火鸡疱疹病毒是通过在火鸡疱疹病毒的UL45-UL46间隔区插入表达IBDVVP2基因的表达盒所构建的。
5.如权利要求4所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述的VP2基因，其氨基酸序列为SEQIDNO:2；其编码基因的...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯玉超，楚电峰，孙鹏，孙化露，李振，于晓璐，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。