溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物制造技术

本发明专利技术公开了溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物，涉及癌症治疗技术领域。本发明专利技术公开的溶瘤病毒其基因组上插入有第一调控元件和第二调控元件；第一调控元件包括癌细胞特异性启动子序列和由该癌细胞特异性启动子驱动在癌细胞中表达特异性蛋白酶的第一核酸序列；第二调控元件包括用于编码胞外牵引信号肽的第二核酸序列和用于编码特异性切割位点的第三核酸序列。该溶瘤病毒可以在癌细胞中以较强的复制能力进行复制以杀死宿主癌细胞，对非癌细胞具有可靠的安全性。

Oncolytic virus and its application and drugs for cancer treatment

【技术实现步骤摘要】
溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物
本专利技术涉及癌症治疗
，具体而言，涉及溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物。
技术介绍
癌症已成为影响健康的第一杀手。我国是癌症尤其是肺癌，胃癌，肝癌及直肠癌高发区。据统计，仅2016年一年全国新增各类癌症患者480万例，230万病人死于各种癌症。随着技术进步，各种新的治疗手段尤其是生物药物治疗不断投入临床使用。但药物的安全性，有效性及病人的生活质量等方面的需求远未得以满足。发展新药或治疗手段是势在必行。1991年，Martuza等人在《Science》杂志发表文章，证明转基因单纯疱疹病毒在恶性胶质瘤治疗中有一定的效果。至此以后，发展溶瘤病毒治疗癌症就日益受到关注。溶瘤病毒治疗癌症的原理是通过对自然界存在的一些致病力较弱的病毒进行基因改造制，让其选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞。同时它还能激发免疫反应，吸引免疫细胞来继续杀死残余癌细胞或通过免疫反应杀灭已迁移的癌细胞。近几十年来，溶瘤病毒相关研究取得了巨大进展。人们先后用新城疫病毒(newcastlediseasevirus，NDV)、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、呼肠孤病毒(reovirus)、溶瘤腺病毒(oncolyticadenovirus)发展溶瘤病毒，且动物试验表明安全有效。但临床表现都远低于预期。不佳的临床表现与目前的溶瘤病毒设计策略有关。目前的溶瘤病毒主要通过消除一个或多个病毒非必须基因或把一个或多个必须基因置于癌症特异性启动子驱动下表达的策略来达到溶瘤病毒在癌细胞选择性的繁殖的目的。删除非必须基因或把必须基因置于癌症特异性启动子驱动下表达都会影响病毒在体内繁殖。简而言之，目前的溶瘤病毒在临床上的不佳表现归功于现有的设计策略。为了增加溶瘤病毒的有效性和广谱性，设计溶瘤病毒时保持病毒基因组完整同时不影响病毒基因表达的时间上的高度协调性至关重要。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种溶瘤病毒，该溶瘤病毒为野生型病毒经遗传工程改造后的重组溶瘤病毒，其可以在癌细胞中以较强的复制能力进行复制以杀死宿主癌细胞，对非癌细胞具有可靠的安全性。本专利技术的另一目的在于提供制备上述溶瘤病毒的核酸分子。本专利技术的另一目的在于提供含有上述核酸分子的载体。本专利技术的另一目的在于提供一种制备上述溶瘤病毒的方法。本专利技术的另一目的在于提供上述溶瘤病毒在癌症治疗中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种治疗癌症的药物。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种溶瘤病毒，其基因组上插入有第一调控元件；所述第一调控元件包括：癌细胞特异性启动子序列和由所述癌细胞特异性启动子驱动在目标癌细胞中表达特异性蛋白酶的第一核酸序列；所述溶瘤病毒的基因组上还插入第二调控元件，所述第二调控元件包括：用于编码胞外牵引信号肽的第二核酸序列和用于编码特异性切割位点的第三核酸序列；所述特异性切割位点被所述特异性蛋白酶识别并切割；所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的5’末端。本专利技术所提供的溶瘤病毒受癌细胞特异性启动子调控，当其感染非癌细胞如正常细胞时，其下游的特异性蛋白酶不表达，因此，胞外牵引信号肽将下游的必需基因序列表达的对病毒复制来说是必需的蛋白牵引至细胞外，导致溶瘤病毒缺乏必要元件，而不能在非癌细胞中复制；而当在其感染癌细胞时，该溶瘤病毒的癌细胞特异性启动子驱动表达特异性蛋白酶，特异性蛋白酶切割位于胞外牵引信号肽与由上述必需基因表达的蛋白之间的特异性切割位点，导致对病毒复制来说所必需的蛋白留在癌细胞内，溶瘤病毒可正常复制，通过其复制杀死癌细胞。本专利技术提供的重组溶瘤病毒没有删除其原始基因组上的任何基因(无论是必需基因还是非必需基因)，其能够以较强的复制能力进行复制，杀死癌细胞。本专利技术这一方面提供的溶瘤病毒的基因组结构示意图可参考图1中A。需要说明的是，第一调控元件的插入位置位于溶瘤病毒的两个基因间(可以是两个必需基因之间，也可以是两个非必需基因，还可以是一个必需基因与一个非必需基因之间)而不影响基因的正常功能。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶(HRV3C蛋白酶)、凝血酶、Xa因子蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV蛋白酶)或重组PreScission蛋白酶。当然，需要说明的是，本专利技术的特异性蛋白酶并不限于如上所描述的蛋白酶，在其他的一些实施例中，本领域技术人员可以根据需要选择适宜的蛋白酶应用到本专利技术中，其均属于本专利技术的保护范围。相应地，本领域技术人员可以根据需要，选择合适的可以被特异性蛋白酶所识别并切割的特异性切割位点应用到本专利技术中。例如：当所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：LEVLFQGP；当所述特异性蛋白酶为凝血酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：LVPRGS；当所述特异性蛋白酶为Xa因子蛋白酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：IE/DGR(IEDGRorIDGR)；当所述特异性蛋白酶为烟草蚀纹病毒蛋白酶时，所述特异性切割位点的序列为：ENLYFQG；当所述特异性蛋白酶为重组PreScission蛋白酶时，所述特异性切割位点的序列为：LEVLFQGP。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述胞外牵引信号肽为干扰素α2、白介素2、人血清白蛋白、人免疫球蛋白重链或源自海洋桡脚类动物的萤光素酶胞外分泌信号肽。当然，需要说明的是，本专利技术的胞外牵引信号肽并不限于如上所描述的类型，在其他的一些实施例中，本领域技术人员可以根据需要选择适宜的胞外牵引信号肽应用到本专利技术的技术方案中，只要其具有牵引与其融合的蛋白至细胞外均可，其均属于本专利技术的保护范围。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的开放阅读框的起始密码子(ATG)与第二三联体密码的之间。当胞外牵引信号肽和必需基因表达时，胞外牵引信号肽通过特异性切割位点序列与必需蛋白融合(由上述必需基因表达)，在特异性切割位点序列未被切割的情况下，必需蛋白被牵引至细胞外，导致溶瘤病毒不能正常复制。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述第一调控元件还包括有增强子序列，所述增强子序列位于所述癌细胞特异性启动子序列和所述特异性蛋白酶编码序列之间，所述增强子序列用于增强所述特异性蛋白酶的表达。本专利技术对增强子序列的具体类型不作限定，只要是能够增强下游基因序列表达的增强子均可以用于本专利技术。优选的，增强子序列为CMV增强子序列或SV40增强子序列。当然，在本专利技术的其他实施例中，本领域技术人员可以根据需要选择合适的增强子序列，无论选用何种增强子只要其目的是用于在癌细胞尤其是癌细胞特异性启动子转录活性低的癌细胞中增强特异性蛋白酶的表达即属于本专利技术的保护范围。通过引入增强子可以提高特异性蛋白酶的表达水平，当溶瘤病毒感染癌细胞时，特异性蛋白酶大量表达，进而可以高效率地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶瘤病毒，其特征在于，其基因组上插入有第一调控元件；所述第一调控元件包括：癌细胞特异性启动子序列和由所述癌细胞特异性启动子驱动在目标癌细胞中表达特异性蛋白酶的第一核酸序列；/n所述溶瘤病毒的基因组上还插入有第二调控元件，所述第二调控元件包括：用于编码胞外牵引信号肽的第二核酸序列和用于编码特异性切割位点的第三核酸序列；所述特异性切割位点被所述特异性蛋白酶识别并切割；/n所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的5’末端。/n

【技术特征摘要】
1.一种溶瘤病毒，其特征在于，其基因组上插入有第一调控元件；所述第一调控元件包括：癌细胞特异性启动子序列和由所述癌细胞特异性启动子驱动在目标癌细胞中表达特异性蛋白酶的第一核酸序列；
所述溶瘤病毒的基因组上还插入有第二调控元件，所述第二调控元件包括：用于编码胞外牵引信号肽的第二核酸序列和用于编码特异性切割位点的第三核酸序列；所述特异性切割位点被所述特异性蛋白酶识别并切割；
所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的5’末端。


2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶、凝血酶、Xa因子蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶或重组PreScission蛋白酶；
优选的，当所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：LEVLFQGP；
当所述特异性蛋白酶为凝血酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：LVPRGS；
当所述特异性蛋白酶为Xa因子蛋白酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：IE/DGR；
当所述特异性蛋白酶为烟草蚀纹病毒蛋白酶时，所述特异性切割位点的序列为：ENLYFQG；
当所述特异性蛋白酶为重组PreScission蛋白酶时，所述特异性切割位点的序列为：LEVLFQGP。


3.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述胞外牵引信号肽为干扰素α2、白介素2、人血清白蛋白、人免疫球蛋白的重链或源自海洋桡脚类动物的萤光素酶胞外分泌信号肽。


4.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的开放阅读框的起始密码子与第二三联体密码之间。


5.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述第一调控元件还包括有增强子序列，所述增强子序列位于所述癌细胞特异性启动子序列和所述特异性蛋白酶编码序列之间，所述增强子序列用于增强所述特异性蛋白酶的表达；
优选的，所述增强子序列为CMV增强子或SV40增强子序列。


6.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述目标癌细胞为肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、脑肿瘤细胞、人结肠癌细胞、宫颈癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、头颈部癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞或食道癌细胞。


7.根据权利要求6所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述癌细胞特异性启动子选自端粒酶逆转录酶启动子、人表皮生长因子受体-2启动子、E2F1启动子、骨钙蛋白启动子、癌胚抗原启动子、Survivin启动子和血浆铜蓝蛋白启动子中的任意一种。


8.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒选自单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒和流感病毒中的任意一种；
优选的，当所述溶瘤病毒为单纯疱疹病毒时，必需基因选自包膜糖蛋白L、尿嘧啶dna糖基化酶、衣壳蛋白、螺旋酶原酶亚基、DNA复制起始结合解旋酶、肉豆蔻酸衍生物蛋白、脱氧核糖核酸酶、外被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、DNA包装末端酶亚基1、外被蛋白UL16、DNA包装蛋白UL17、衣壳三链亚基2、主要衣壳蛋白、包膜蛋白UL20、核蛋白UL24、DNA包装蛋白UL25、衣壳成熟蛋白酶、衣壳蛋白、包膜糖蛋白B、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶催化亚基、核出口层蛋白、DNA包装蛋白UL32、DNA包装蛋白UL33、核出口膜蛋白、大衣壳蛋白、衣壳三链亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基2、被膜宿主关闭蛋白、DNA聚合酶加工性亚基、膜蛋白UL45、外被蛋白VP13/14、反式激活蛋白VP16、外被蛋白VP22、包膜糖蛋白N、外被蛋白UL51、解旋酶-引发酶引物酶亚基、包膜糖蛋白K、ICP27、核蛋白UL55、核蛋白UL56、转录调节因子ICP4、调节蛋白ICP22、包膜糖蛋白D和膜蛋白US8A中的一种或多种；
优选的，当所述溶瘤病毒为腺病毒时，必需基因选自早期蛋白1A、早期蛋白1B19K、早期蛋白1B55K、壳体化蛋白Iva2、DNA聚合酶、末端蛋白前体pTP、壳体化蛋白52K、衣壳蛋白前体pIIIa、五邻体基质、核心蛋白pVII、核心蛋白前体pX、核心蛋白前体pVI、六邻体、蛋白酶、单链DNA结合蛋白、六聚体组装蛋白100K、蛋白33K、壳体化蛋白22K、衣壳蛋白前体、蛋白U、纤维蛋白、调控蛋白E4开放阅读框6/7、调控蛋白E434K、调控蛋白E4开放阅读框4、调控蛋白E4开放阅读框3、调控蛋白E4开放阅读框2和调控蛋白E4开放阅读框1中的一种或多种，
优选的，当所述溶瘤病毒为牛痘病毒时，必需基因选自核苷酸还原酶小亚基、丝氨酸/苏氨酸激酶、DNA结合病毒核心蛋白、聚合酶大亚基、RNA聚合酶亚基、DNA聚合酶、巯基氧化酶、假定DNA结合病毒核蛋白、DNA结合磷蛋白、病毒核心半胱氨酸蛋白酶、RNA螺旋酶NPH-II、假定金属蛋白酶、转录延伸因子、谷胱甘肽类蛋白、RNA聚合酶、假定病毒核蛋白、晚期转录因子VLTF-1、DNA结合病毒核蛋白、病毒衣壳蛋白、聚合酶小亚基、依赖...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍泽堂，
申请(专利权)人：伍泽堂，
类型：发明
国别省市：安徽;34