重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物技术

本发明专利技术公开了重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物，涉及生物技术领域。本发明专利技术公开的重组溶瘤病毒的基因组序列上含有如下外源元件：(1)含有第一启动子和第一干扰RNA表达序列的第一表达盒；(2)靶标序列；以及(3)第二表达盒。该重组溶瘤病毒的繁殖或复制受到其基因组序列上所插入的外源元件调控，通过这些外源元件的调控，使得该重组溶瘤病毒可以在不同类型的细胞中选择性繁殖或复制，通过选择性的繁殖或复制进而可选择性地杀死第二细胞即靶细胞(例如肿瘤细胞)而对第一细胞即非靶细胞(例如正常细胞)不造成伤害。

【技术实现步骤摘要】
重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物。
技术介绍
癌症已经成为威胁人类健康的主要杀手。《2015全球癌症统计》数据显示：2015年全球新增病例约1410万例，死亡人数达820万。2015年中国新发癌症病例429万人和死亡病例达281万人。目前治疗癌症主要靠传统的手术切除，放疗和化疗。手术切除一定程度上能解除患者痛苦，但对于位于体内深部的癌症无以为助，并对已扩散的肿瘤更是无能为力。放疗和化疗在临床上已使用多年，但因无选择性副作用大且存在着大剂量致死性的潜在风险。近年来尤其在过去的五年，抗体和CART在治疗癌症方面的潜力和应用越来越受到关注。抗体治疗能缓解癌症病情发展，但普遍治疗效果欠佳，现广泛认为抗体治疗更适宜做辅助治疗。CART治疗精准靶向且有可能彻底根除癌症，但CART治疗主要适合血癌，且一个治疗方案只适合一个给定的病人，因此治疗费用对一般癌症患者高不可及，更大的问题是CART治疗一旦脱靶，将置病人于死地。为了安全高效治疗癌症和减少癌症患者的痛苦，用全新的策略开发新药物是势在必行。在多项可能的选择中，遗传工程改造溶瘤病毒治疗癌症显得尤为有吸引力因为溶瘤病毒治疗无耐药性，安全且有效。病毒感染延缓肿瘤增大或让肿瘤消失早在100年前已有临床观察，随后人们甚至用乙肝病人血浆或乙肝病人血浆提取物来治疗霍奇金病。但人们并不认为病毒是治疗癌症的可行性选择因为无法让病毒仅在癌细胞中生长和繁殖。20世纪90年代，分子生物学技术的进步为遗传工程改造病毒使其拥有癌细胞特异的趋向性铺平了道路。早期研究主要发展繁殖缺陷型裂解病毒(病毒感染后，在细胞中繁殖杀死细胞，从杀死的细胞中释放出来并感染临近细胞。比如腺病毒，新城疫病毒和疱疹病毒)和繁殖缺陷型非裂解病毒(比如腺病毒相关病毒及慢病毒)表达免疫分子(GMCSF，IL-12，IL-17)或免疫反应刺激因子(TNFα，IFNα)通过增强免疫反应来治疗癌症。由于基于病毒的免疫疗法像传统的免疫治疗一样，临床效果普遍欠佳，认为应主要作为辅助治疗。为了增强病毒在癌症治疗上的作用，近年来的研究主要是关注于利用遗传工程改造裂解病毒使其选择性地在癌细胞中繁殖(溶瘤病毒)通过瘤内注射让其在原灶肿瘤细胞中繁殖杀死癌细胞(溶瘤性)并通过裂解的癌细胞碎片次生引发癌症特异的免疫反应杀灭已扩散的癌细胞从而达到治疗癌症的目的。由于溶瘤病毒安全并且一个溶瘤病毒拥有治疗多种癌症的潜力，溶瘤病毒在治疗癌症方面的应用前景值得预期。美国，欧盟及澳大利亚于2015和2016年先后批准临床使用美国Amgen公司的基于I型疱疹病毒的溶瘤病毒Tvec治疗黑色素瘤开创了溶瘤病毒在治疗癌症方面的新纪元。随后溶瘤病毒研发如火如荼，仅2017年全世界就有多达80个用溶瘤病毒治疗各种癌症的临床测试。多种溶瘤病毒在单一动物模型上都有不错的表现，但在临床上虽然安全但普遍响应率和治愈率远不理想。
技术实现思路
本专利技术的目的包括但不限于提供一种新的重组溶瘤病毒、用于制备该病毒的核酸序列和方法、该重组溶瘤病毒在癌症治疗方面的相关应用以及含有该重组溶瘤病毒的药物等。该重组溶瘤病毒的繁殖或复制受到其基因组序列上所插入的外源元件调控，通过这些外源元件的调控，使得该重组溶瘤病毒可以在不同类型的细胞中选择性繁殖或复制，通过选择性的繁殖或复制进而可选择性地杀死靶细胞(如肿瘤细胞)而对非靶细胞(例如正常细胞)不造成伤害。本专利技术是这样实现的：目前的溶瘤病毒主要通过消除一个或多个病毒非必须基因或把一个或多个必须基因置于癌症特异性启动子驱动下表达的策略来达到溶瘤病毒在癌细胞选择性的繁殖的目的。病毒在体外繁殖不需要非必须基因，但非必须基因在体内行使多种功能比如拮抗寄主抗病毒机制等以利于病毒繁殖。利用把一个或多个必须基因置于癌症特异性启动子驱动下表达的策略构建的溶瘤病毒虽然病毒基因完整但改变了病毒基因表达在时间上的高度协调性。因此，删除非必须基因或把必须基因置于癌症特异性启动子驱动下表达都会影响病毒在体内繁殖。简而言之，目前的溶瘤病毒在临床上的不佳表现归功于现有的设计策略。为了增加溶瘤病毒的有效性和广谱性，设计溶瘤病毒时保持病毒基因组完整同时不影响病毒基因表达的时间上的高度协调性至关重要。以此为指南，本专利技术采用了新奇策略发展和制作了全新的溶瘤病毒。第一方面，本专利技术提供了一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒的基因组序列上含有如下外源元件：(1)含有第一启动子和第一干扰RNA表达序列的第一表达盒；(2)靶标序列；以及(3)第二表达盒；其中，所述第一干扰RNA表达序列用于表达结合至所述靶标序列的第一干扰RNA；所述第一干扰RNA表达序列由所述第一启动子驱动以在第一细胞中表达所述第一干扰RNA；所述靶标序列位于所述重组溶瘤病毒复制所必需的必需基因的5’末端非编码区或3’末端非编码区；所述第二表达盒含有第二启动子和抑制成分表达序列；所述抑制成分表达序列用于表达抑制成分，所述抑制成分用于抑制酶的生物合成和/或生物活性，所述酶为参与干扰RNA生物合成所需的酶；所述抑制成分表达序列由所述第二启动子驱动以在第二细胞中不在所述第一细胞中表达所述抑制成分；所述第一细胞和所述第二细胞的类型不同。本专利技术提供的重组溶瘤病毒通过在其基因组上插入外源的第一干扰RNA的靶标序列、第一表达盒和第二表达盒等外源元件(参考图1)，并利用第一启动子驱动在第一细胞(非靶细胞，如正常细胞)中表达第一干扰RNA，利用第二启动子驱动在第二细胞(靶细胞，如肿瘤细胞)中表达抑制成分且在第一细胞中不表达该抑制成分的调控策略，使得在该重组溶瘤病毒感染第一细胞时，表达的第一干扰RNA结合至位于病毒必需基因的5’末端或3’末端的非编码区的干扰RNA的靶标序列上阻止必需基因的翻译，进而抑制病毒的繁殖或复制，对第一细胞不产生或产生很低的杀伤作用，而当重组溶瘤病毒感染第二细胞时，由于第二动子驱动表达的抑制成分抑制了参与干扰RNA合成的酶的生物合成和/或生物活性，第一干扰RNA不能实现干扰功能。这样必需基因可以正常转录和翻译，进而该重组溶瘤病毒可以在第二细胞中进行繁殖或复制，对第二细胞造成杀伤效果。与现有的重组溶瘤病毒不同，本专利技术提供的重组溶瘤病毒既能保持病毒基因组完整又不打乱病毒基因高度有序的表达，同时可以选择性地在第二细胞中以如野生型病毒或接近野生型病毒的能力繁殖或复制对第二细胞造成杀伤而对第一细胞无杀伤作用，对第一细胞安全。因此，该重组溶瘤病毒具有广泛的用途，例如利用本专利技术的重组溶瘤病毒可以实现以较高的杀伤效率对第二细胞例如肿瘤细胞产生杀伤作用，而对第一细胞例如正常细胞不具有杀伤作用，达到安全高效的目的。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述第一表达盒还具有用于表达第二干扰RNA的第二干扰RNA表达序列，所述第二干扰RNA作用于所述重组溶瘤病毒复制非必需的非必需基因的开放阅读框以干扰所述非必需基因表达，所述第二干扰RNA表达序列由所述第一启动子驱动表达。通过利用第二干扰RNA，当病毒感染第一细胞时，第二干扰RNA同样可结合至病毒的非必需基因的开放阅读框，抑制非必需基因的翻译，干扰其表达，与第一干扰RNA的作用类似，以尽可能地抑制在第一细胞中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒的基因组序列上含有如下外源元件：(1)含有第一启动子和第一干扰RNA表达序列的第一表达盒；(2)靶标序列；以及(3)第二表达盒；其中，所述第一干扰RNA表达序列用于表达结合至所述靶标序列的第一干扰RNA；所述第一干扰RNA表达序列由所述第一启动子驱动以在第一细胞中表达所述第一干扰RNA；所述靶标序列位于所述重组溶瘤病毒复制所必需的必需基因的5’末端非编码区或3’末端非编码区；所述第二表达盒含有第二启动子和抑制成分表达序列；所述抑制成分表达序列用于表达抑制成分，所述抑制成分用于抑制酶的生物合成和/或生物活性，所述酶为参与干扰RNA生物合成所需的酶；所述抑制成分表达序列由所述第二启动子驱动以在第二细胞中不在所述第一细胞中表达所述抑制成分；所述第一细胞和所述第二细胞的类型不同。

【技术特征摘要】
1.一种重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒的基因组序列上含有如下外源元件：(1)含有第一启动子和第一干扰RNA表达序列的第一表达盒；(2)靶标序列；以及(3)第二表达盒；其中，所述第一干扰RNA表达序列用于表达结合至所述靶标序列的第一干扰RNA；所述第一干扰RNA表达序列由所述第一启动子驱动以在第一细胞中表达所述第一干扰RNA；所述靶标序列位于所述重组溶瘤病毒复制所必需的必需基因的5’末端非编码区或3’末端非编码区；所述第二表达盒含有第二启动子和抑制成分表达序列；所述抑制成分表达序列用于表达抑制成分，所述抑制成分用于抑制酶的生物合成和/或生物活性，所述酶为参与干扰RNA生物合成所需的酶；所述抑制成分表达序列由所述第二启动子驱动以在第二细胞中不在所述第一细胞中表达所述抑制成分；所述第一细胞和所述第二细胞的类型不同。2.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述第一表达盒还具有用于表达第二干扰RNA的第二干扰RNA表达序列，所述第二干扰RNA作用于所述重组溶瘤病毒复制非必需的非必需基因的开放阅读框以干扰所述非必需基因表达，所述第二干扰RNA表达序列由所述第一启动子驱动表达。3.根据权利要求2所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述第一干扰RNA和所述第二干扰RNA各自独立地为小干扰RNA或microRNA。4.根据权利要求2所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述第二细胞为哺乳动物肿瘤细胞，所述第一细胞为哺乳动物非肿瘤细胞；优选的，所述哺乳动物为人；优选的，所述肿瘤细胞为肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、脑肿瘤细胞、人结肠癌细胞、宫颈癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、头颈部癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞或食道癌细胞。5.根据权利要求2所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述靶标序列选自非哺乳动物的基因的小段序列；优选的，所述靶标序列选自所述非哺乳动物的基因中的开放阅读框长为19-23个核苷酸的核苷酸序列；优选的，所述非哺乳动物为酵母、水母、大肠杆菌、昆虫、鱼或植物；优选的，所述非哺乳动物的基因为源自水母的绿色荧光蛋白基因、源自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因和源自萤火虫的荧光素酶基因中的任意一种。6.根据权利要求5所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述靶标序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示，所述第一干扰RNA的碱基序列如SEQIDNO.2所示。7.根据权利要求1-6任一项所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒的一个或多个必需基因的5’末端非编码区或3’末端非编码区插入有所述靶标序列；优选的，所述靶标序列在其所插入的任意一位置上的拷贝数为一个或多个。8.根据权利要求7所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒选自单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒和流感病毒中的任意一种；优选的，当所述重组溶瘤病毒为单纯疱疹病毒时，必需基因选自包膜糖蛋白L、尿嘧啶dna糖基化酶、衣壳蛋白、螺旋酶原酶亚基、DNA复制起始结合解旋酶、肉豆蔻酸衍生物蛋白、脱氧核糖核酸酶、外被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、DNA包装末端酶亚基1、外被蛋白UL16、DNA包装蛋白UL17、衣壳三链亚基2、主要衣壳蛋白、包膜蛋白UL20、核蛋白UL24、DNA包装蛋白UL25、衣壳成熟蛋白酶、衣壳蛋白、包膜糖蛋白B、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶催化亚基、核出口层蛋白、DNA包装蛋白UL32、DNA包装蛋白UL33、核出口膜蛋白、大衣壳蛋白、衣壳三链亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基2、被膜宿主关闭蛋白、DNA聚合酶加工性亚基、膜蛋白UL45、外被蛋白VP13/14、反式激活蛋白VP16、外被蛋白VP22、包膜糖蛋白N、外被蛋白UL51、解旋酶-引发酶引物酶亚基、包膜糖蛋白K、ICP27、核蛋白UL55、核蛋白UL56、转录调节因子ICP4、调节蛋白ICP22、包膜糖蛋白D和膜蛋白US8A，非必需基因选自ICP34.5、ICP0、核蛋白UL3、核蛋白UL4、螺旋酶原酶螺旋酶亚基、表皮蛋白UL7、包膜糖蛋白M、外被蛋白UL14、外被蛋白UL21、包膜糖蛋白H、胸苷激酶、DNA包装终止酶亚基2、小衣壳蛋白、外壳蛋白UL37、包膜蛋白UL43、包膜糖蛋白C、外被蛋白VP11/12、脱氧尿苷三磷酸酶、ICP0、病毒蛋白US2、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶U3、膜G醣蛋白、包膜糖蛋白J、包膜糖蛋白I、包膜糖蛋白E、膜蛋白US9、病毒蛋白US10、表皮蛋白Us11和ICP47中的一种或多种；优选的，当所述重组溶瘤病毒为腺病毒时，必需基因选自早期蛋白1A、早期蛋白1B19K、早期蛋白1B55K、壳体化蛋白Iva2、DNA聚合酶、末端蛋白前体pTP、壳体化蛋白52K、衣壳蛋白前体pIIIa、五邻体基质、核心蛋白pVII、核心蛋白前体pX、核心蛋白前体pVI、六邻体、蛋白酶、单链DNA结合蛋白、六聚体组装蛋白100K、蛋白33K、壳体化蛋白22K、衣壳蛋白前体、蛋白U、纤维蛋白、调控蛋白E4开放阅读框6/7、调控蛋白E434K、调控蛋白E4开放阅读框4、调控蛋白E4开放阅读框3、调控蛋白E4开放阅读框2和调控蛋白E4开放阅读框1中的一种或多种，非必需基因选自衣壳蛋白IX、蛋白13.6K、核心蛋白V、调控蛋白E312.5K、膜糖蛋白E3CR1-α、膜糖蛋白E3gp19K、膜糖蛋白E3CR1-β、膜糖蛋白E3CR1-δ、膜糖蛋白E3RID-δ和膜糖蛋白E314.7K中的一种或多种；优选的，当所述重组溶瘤病毒为牛痘病毒时，必需基因选自核苷酸还原酶小亚基、丝氨酸/苏氨酸激酶、DNA结合病毒核心蛋白、聚合酶大亚基、RNA聚合酶亚基、DNA聚合酶、巯基氧化酶、假定DNA结合病毒核蛋白、DNA结合磷蛋白、病毒核心半胱氨酸蛋白酶、RNA螺旋酶NPH-II、假定金属蛋白酶、转录延伸因子、谷胱甘肽类蛋白、RNA聚合酶、假定病毒核蛋白、晚期转录因子VLTF-1、DNA结合病毒核蛋白、病毒衣壳蛋白、聚合酶小亚基、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo22、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo147、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、IMV肝素结合表面蛋白、DNA依赖性RNA聚合酶、晚期转录因子VLTF-4、DNA拓扑异构酶Ⅰ型、mRNA盖酶大亚基、病毒核心蛋白107、病毒核心蛋白108、尿嘧啶-DNA糖基酶、三磷酸酶、早期基因转录因子VETF的70kDa小亚基、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo18、核苷三磷酸水解酶-I、mRNA盖酶小亚基、利福平靶点、晚期转录因子VLTF-2、晚期转录因子VLTF-3、二硫键形成途径、核心蛋白4b前体p4b、核心蛋白39kDa、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo19、早期基因转录因子VETF的82kDa大亚基、转录因子VITF-3的32kDa小亚基、IMV膜蛋白128、核心蛋白4a前体P4a、IMV膜蛋白131、磷酸化IMV膜蛋白、IMV膜蛋白A17L、DNA解旋酶、病毒DNA聚合酶加工因子、IMV膜蛋白A21L、棕榈酰蛋白、中间基因转录因子VITF-3的45kDa大亚基、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo132、依赖于DNA的RNA聚合酶rpo35、IMV蛋白A30L、假定的ATP酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、EEV成熟蛋白、棕榈酰化的EEV膜糖蛋白、IMV表面蛋白A27L、EEV膜磷酸糖蛋白、IEV和EEV膜糖蛋白、EEV膜糖蛋白、二硫键形成途径蛋白、假定的病毒核蛋白、IMV膜蛋白I2L、痘病毒肉豆蔻酰基蛋白、IMV膜蛋白L1R、晚期16kDa假定的膜蛋白、假定的病毒膜蛋白H2R、IMV膜蛋白A21L、趋化因子结合蛋白、表皮生长因子样蛋白和IL-18结合蛋白中的一种或多种，非必需基因选自分泌补体结合蛋白、kelch样蛋白、类毒力因子、假定的α-氨基蛋白敏感蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍泽堂，
申请(专利权)人：伍泽堂，
类型：发明
国别省市：安徽,34