一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，要解决的是现有治疗RHD的疫苗中存在的问题。本发明专利技术具体步骤如下：步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体；步骤二，制备CEF单层细胞；步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组；步骤四，鸡痘病毒的筛选。本发明专利技术应用基因重组技术，构建含有IL‑18的重组鸡痘疫苗，再经过加压筛选、鉴定、培养、浓缩后的毒力测定，免疫原性的检测，具有易培养、易储存、无毒性扩散、易生产、提高免疫效果、节省资金等优点，应用前景广阔。

Preparation of a Recombinant Fowlpox Virus Vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法
本专利技术涉及兔出血症治疗领域，具体是一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法。
技术介绍
兔出血症(Rabbithemorrhagicdisease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV)引起的一种急性、高度传染性、高致死性的疾病，以呼吸系统出血、实质器官水肿、淤血及出血变化为特征，给养兔业带来巨大的经济损失，曾是兔的一种毁灭性传染病而备受关注。该病于1984年在我国江苏省的江阴县首次被发现，之后迅速蔓延至全国25个省、市、自治区。迄今亚洲的朝鲜、印度和黎巴嫩、美洲的墨西哥、非洲的喀麦隆和欧洲的奥地利、比利时、捷克、丹麦、法国、德国、希腊、卢森堡、荷兰、波兰、西班牙、瑞典、瑞士及南斯拉夫等国也都有发生。该病常呈暴发性流行，发病率及病死率极高，对易感动物致病率达90％，病死率高达100％，是危害养兔业的最严重的疾病之一。对RHDV感染至今尚无有效治疗药物，所能应用的治疗措施仅限于对症治疗和支持治疗。目前，各国都加大了RHDV疫苗的研究力度，以便能够对RHDV感染进行有效的预防和治疗。使用的组织灭活疫苗预防该病，但存在着散毒、生产成本不断增加等潜在的缺点以及动物福利等问题，使得研究人员致力于基因工程疫苗的研制以达到预防该病的效果。现在的RHDV疫苗制备主要以RHDV病毒接种家兔后，分离肝脏，研磨过滤灭菌后，但是病毒的体外培养仍是难题,还没有找到合适的体外培养细胞，有使用期限，过期后疫苗失效。现仍用该病死兔的肝脏制灭活苗,因灭活不彻底有导致散毒可能,故有必要在病毒结构和体外易感细胞上突破,研制基因疫苗是当下乃至将来的发展趋势。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，具体步骤如下：步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体：将RHDV结构蛋白VP60插入复合启动子的下游，将IL-18基因插入串联启动子的下游，构建了含有RHDV结构蛋白VP60和IL-18的鸡痘病毒中间转移载体。步骤二，制备CEF单层细胞：取9-11日龄无特定病原体鸡胚，分别用碘酒、酒精棉对鸡胚进行擦拭消毒后放在超净台内，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子敲破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，再用心的无菌镊子接开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入蛋壳内取出鸡胚后放入平皿中，去头、四肢、内脏，剪碎成小块，再用PBS清洗3遍，至组织款发白为止。将剪碎的组织小块移入另一小平皿内，加入适量的胰酶(0.5％)和磷酸盐缓冲液，于37℃细胞培养箱中消化10分钟左右，倒掉液体后加入生长液，用枪头反复吹成单个细胞，再用灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬液稀释10倍，使细胞终止浓度到达50万个/ml，每个细胞瓶中加入8ml，放入二氧化碳培养箱中，将培养至CEF(胚胎成纤维细胞)细胞长成融合单层，待用。步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组：取新制备的生长状态良好的CEF细胞，倒掉其中的培养液，清洗并且加入胰酶，静置至壁上细胞全部消化下来，倾去并洗去残留胰酶，选择融合度为70～80％的融合单层CEF细胞，吸去培养上清液，然后按0.1moL接种FPV282E4株(由军事医学科学院军事兽医研究惠赠)，吸附，在鸡痘病毒吸附培养的同时，向85μL的MEM完全培养液中加入15μLDOTAPLiposomal(脂质体转染试剂)，轻轻混匀，得到前混合物，另取50mLMEM完全培养液加入10～20μg鸡痘病毒中间转移载体并且混匀，得到后混合物，然后将后混合物滴加于前混合物中轻轻吹打混匀，待鸡痘病毒吸附1.5～3h后，将质粒与转染试剂的混合液加到上述单层细胞上，并用无血清MEM完全培养液将每孔中的液体补足至1mL，培养12～18h，然后每孔补加MEM完全培养液，继续培养72～120h收病毒，-70℃保存；步骤四，鸡痘病毒的筛选：向MEM完全培养液中加入BrdU(胸腺嘧啶核苷类似物)，10～14小时后吸去MEM完全培养液，接种步骤三得到的病毒，再用含BrdU的培养液将每孔中的液体补足至3ml，接种病毒后120h收获细胞，将收获细胞接种于BrdU预处理后的CEF单层细胞上，继续培养120h，收获细胞，经过三次BrdU加压筛选后，将收获的细胞再接种于CEF单层细胞上，在无BrdU的条件下培养，挑选单个病毒蚀斑，并进行三次蚀斑纯化、扩增，再筛选重组病毒；步骤五，鉴定重组病毒：将重组病毒接种于玻片上的融合单层CEF上，同时设亲本FPV和正常细胞对照。在37℃，CO2体积分数为5％的条件下吸附培养1.5～2.5h，继续培养至细胞出现明显病变后，取出玻片，将玻片置于玻璃器皿中，用PBS(pH7.2)或TBS洗涤缓冲液洗一次，100％丙酮固定10～15min，再用PBS冲洗3次后，与适当稀释后的兔抗Asia1型FMDV阳性血清37℃反应2h，用PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗(1:100)在37℃反应30min，用PBS洗涤3次，再用TBS洗涤缓冲液和蒸馏水各洗一次，载玻片上加一滴甘油缓冲液(甘油的质量分数为50％的PBS)，将载有细胞的玻片反扣于载玻片上，于荧光显微镜下观察和拍照。作为本专利技术实施例进一步的方案：步骤一中复合启动子为ATI-P7.5×20(由军事医学科学院军事兽医研究所金宁一院士惠赠)，串联启动子为P7.5×16(由军事医学科学院军事兽医研究所金宁一院士惠赠)。作为本专利技术实施例进一步的方案：步骤二中病毒滴度的计算公式为：病毒滴度(PFU/mL)＝病毒空斑数×稀释倍数/接种量。作为本专利技术实施例进一步的方案：步骤三中吸附和培养的条件均为37℃和CO2的体积分数为5％。作为本专利技术实施例进一步的方案：步骤四中将收获细胞冻融3次后，再接种于BrdU预处理后的CEF单层细胞上。作为本专利技术实施例进一步的方案：步骤四中筛选重组病毒的方法包括间接免疫荧光实验和Westernblotting检测。作为本专利技术实施例进一步的方案：步骤二中添加MEM完全培养液并且继续培养24～48h的培养条件为37℃，湿度为60～80％，CO2的体积分数为5％，MEM完全培养液中甲基纤维素的质量分数为1％，小牛血清的质量分数为4％。IL-18是一种新近发现的细胞因子，具有多种生物学功能。它由单核-巨噬细胞和上皮细胞产生，可激活NK细胞，刺激激活的T细胞产生GM-CSF、IL-2、IFN-γ，抑制激活的T细胞产生IL-10。研究发现，IL-18可通过调节IFN的表达提高机体的免疫水平，起到免疫佐剂作用，从而达到控制和预防微生物感染。因此，将IL-18与RHDV结构基因VP60共表达，以起到基因佐剂的作用，构建共表达结构蛋白VP60、分子佐剂的重组鸡痘病毒疫苗，有效地提高接种动物的细胞免疫和体液免疫水平，预防该病的发生和流行，减少巨大的经济损失。与现有技术相比，本专利技术实施例的有益效果是：本专利技术应用基因重组技术，构建含有IL-18的重组鸡痘疫苗，再经过加压筛选、鉴定、培养、浓缩后的毒力测定，免疫原性的检测，具有易培养、易储存、无毒性扩散、易生产、提高免疫效果、节省资金等优点，应用前景广阔。附图说明图1为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体：将RHDV结构蛋白VP60插入复合启动子的下游，将IL‑18基因插入串联启动子的下游，构建了含有RHDV结构蛋白VP60和IL‑18的鸡痘病毒中间转移载体；步骤二，制备CEF单层细胞：取9‑11日龄无特定病原体鸡胚，分别用碘酒、酒精棉对鸡胚进行擦拭消毒后放在超净台内，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子敲破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，再用心的无菌镊子接开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入蛋壳内取出鸡胚后放入平皿中，去头、四肢、内脏，剪碎成小块，再用PBS清洗3遍，至组织款发白为止，将剪碎的组织小块移入另一小平皿内，加入适量的胰酶和磷酸盐缓冲液，于37℃细胞培养箱中消化10分钟左右，倒掉液体后加入生长液，用枪头反复吹成单个细胞，再用灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬液稀释10倍，使细胞终止浓度到达50万个/ml，每个细胞瓶中加入8ml，放入二氧化碳培养箱中，将培养至CEF细胞长成融合单层，待用；步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组：取新制备的生长状态良好的CEF细胞，倒掉其中的培养液，清洗并且加入胰酶，静置至壁上细胞全部消化下来，倾去并洗去残留胰酶，选择融合度为70～80％的融合单层CEF细胞，吸去培养上清液，然后按0.1moL接种FPV 282E4株，吸附，在鸡痘病毒吸附培养的同时，向85μL的MEM完全培养液中加入15μL DOTAP Liposomal，轻轻混匀，得到前混合物，另取50mL MEM完全培养液加入10～20μg鸡痘病毒中间转移载体并且混匀，得到后混合物，然后将后混合物滴加于前混合物中轻轻吹打混匀，待鸡痘病毒吸附1.5～3h后，将质粒与转染试剂的混合液加到上述单层细胞上，并用无血清MEM完全培养液将每孔中的液体补足至1mL，培养12～18h，然后每孔补加MEM完全培养液，继续培养72～120h收病毒，‑70℃保存；步骤四，鸡痘病毒的筛选：向MEM完全培养液中加入BrdU，10～14小时后吸去MEM完全培养液，接种步骤三得到的病毒，再用含BrdU的培养液将每孔中的液体补足至3ml，接种病毒后120h收获细胞，将收获细胞接种于BrdU预处理后的CEF单层细胞上，继续培养120h，收获细胞，经过三次BrdU加压筛选后，将收获的细胞再接种于CEF单层细胞上，在无BrdU的条件下培养，挑选单个病毒蚀斑，并进行三次蚀斑纯化、扩增，再筛选重组病毒。...

【技术特征摘要】
1.一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体：将RHDV结构蛋白VP60插入复合启动子的下游，将IL-18基因插入串联启动子的下游，构建了含有RHDV结构蛋白VP60和IL-18的鸡痘病毒中间转移载体；步骤二，制备CEF单层细胞：取9-11日龄无特定病原体鸡胚，分别用碘酒、酒精棉对鸡胚进行擦拭消毒后放在超净台内，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子敲破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，再用心的无菌镊子接开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入蛋壳内取出鸡胚后放入平皿中，去头、四肢、内脏，剪碎成小块，再用PBS清洗3遍，至组织款发白为止，将剪碎的组织小块移入另一小平皿内，加入适量的胰酶和磷酸盐缓冲液，于37℃细胞培养箱中消化10分钟左右，倒掉液体后加入生长液，用枪头反复吹成单个细胞，再用灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬液稀释10倍，使细胞终止浓度到达50万个/ml，每个细胞瓶中加入8ml，放入二氧化碳培养箱中，将培养至CEF细胞长成融合单层，待用；步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组：取新制备的生长状态良好的CEF细胞，倒掉其中的培养液，清洗并且加入胰酶，静置至壁上细胞全部消化下来，倾去并洗去残留胰酶，选择融合度为70～80％的融合单层CEF细胞，吸去培养上清液，然后按0.1moL接种FPV282E4株，吸附，在鸡痘病毒吸附培养的同时，向85μL的MEM完全培养液中加入15μLDOTAPLiposomal，轻轻混匀，得到前混合物，另取50mLMEM完全培养液加入10～20μg鸡痘病毒中间转移载体并且混匀，得到后混合物，然后将后混合物滴加于前混合物中轻轻吹打混匀，待鸡痘病毒吸附1.5～3h后，将质粒与转染试剂的混合液加到上述单层细胞上...

【专利技术属性】
技术研发人员：金明兰，
申请(专利权)人：吉林建筑大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22