本发明专利技术公开了一种腺病毒颗粒获得方法，具体涉及腺病毒获取领域，具体操作步骤如下：S1、pshuttle‑cmv‑hTERT穿梭质粒的构建；S2、BJ5183/p超级感受态的制备；S3、同源重组腺病毒质粒构建；S4、腺病毒颗粒收集。本发明专利技术通过pshuttle‑cmv‑hTERT穿梭质粒的构建、BJ5183/p超级感受态的制备、同源重组腺病毒质粒构建以及腺病毒颗粒收集共四个步骤，能够稳定的获取腺病毒，且每次获取的腺病毒颗粒数都能够保持稳定，相比于现有技术中腺病毒的获取，获取效率以及稳定性都得到了很大的提高。
A Method for Obtaining Adenovirus Particles
【技术实现步骤摘要】
一种腺病毒颗粒获得方法
本专利技术涉及腺病毒获取
，更具体地说，本专利技术涉及一种腺病毒颗粒获得方法。
技术介绍
近年来的研究发现PDLCs有类似间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)功能的细胞，能在体外分化为成骨细胞，脂肪细胞及神经样细胞，使牙周组织的再生成为可能，遗憾的是牙周膜的再生机制尚不明晰。牙周膜的再生研究方面，主要受限于原代PDLCs的传代培养会降低细胞的分化潜能，并失去原代特性，比如，不同代数牙周膜的成骨分化能力差异非常大。所以建立与原代PDLCs表型和生长特性相同，并能稳定传代的PDLCs细胞系，对牙周膜再生机制的研究提供细胞平台，有着重大的意义。构建保留原代细胞特征的稳定的人PDLCs细胞系存在诸多难点。Kamata等人通过共转染hTERT和人乳头状瘤细胞病毒16成功构建了人PDLCs系，可是这些细胞失去了钙化潜能。本研究组在前期研究中发现，通过导入各种抑癌基因以期构建稳定的细胞系时，细胞的形态，生长状态都可能发生改变。而人端粒反转转录酶(Humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)是细胞内正常基因，诱导端粒长度伸长并延伸体细胞的复制寿命，相对于传统的永生化基因，端粒酶转染建立的细胞系是正常细胞而非转化细胞，具有正常的核型和生长速度。研究表明，通过慢病毒过表达hTERT可以构建PDLCs细胞系，但hTERT基因片段大，重组病毒的滴度不高，表达hTERT效率低，效果不理想。而重组腺病毒是比较高效和可靠的重组病毒表达系统之一，其病毒滴度高，可以更有效地介导hTERT的表达。腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含4.7kb，两端各有长约100bp的反向重复序列。由于每条DNA链的5'端同相对分子质量为55X103Da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链DNA的环状结构。现有技术中腺病毒颗粒获得需要人工培养，获取腺病毒颗粒不稳定，培养的效率不高。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的实施例提供一种腺病毒颗粒获得方法，通过pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建、BJ5183/p超级感受态的制备、同源重组腺病毒质粒构建以及腺病毒颗粒收集共四个步骤，能够稳定的获取腺病毒，且每次获取的腺病毒颗粒数都能够保持稳定，相比于现有技术中腺病毒的获取，获取效率以及稳定性都得到了很大的提高。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种腺病毒颗粒获得方法，具体操作步骤如下：S1、pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建；S1.1、根据NCBIhTERT基因cDNA序列设计引物，引物包括上游引物和下游引物；S1.2、在上游引物添加HindIII酶切位点及保护碱基，在下游引物添加KpnI酶切位点保护碱基；S1.3、参照高保真DNA聚合酶PlatinumPfxDNAPolymerase说明书，采用PCR法特异性扩增hTERT基因编码序列，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到大小为3.3kb条带；S1.4、将限制性内切酶HindIII、KpnI双酶切hTERT和pshuttle-cmv进行酶切，得到酶切产物胶，回收后使用T4连接酶连接得到连接产物，接着将连接产物加入Trans-T1感受态细胞中将其转化，然后使用质粒小量提取试剂盒说明书进行抽提质粒，最后用PmeI酶切鉴定抽提的质粒，将鉴定为阳性的质粒进行测序；S2、BJ5183/p超级感受态的制备；S2.1、采用热激法将质粒pAd-Easy-1转化成BJ5183感受态，然后涂氨苄霉素琼脂板，挑取单克隆；S2.2、采用Inoue方法制备含pAd-Easy-1的BJ5183超级感受态，命名为BJ5183/p；S3、同源重组腺病毒质粒构建；S3.1、用PmeI酶切pshuttle-cmv-TERT质粒使其线性化，然后采用热激法将其转化成超级感受态BJ5183/p；S3.2、涂氨苄抗性琼脂板，挑取10个菌落较小的单克隆，进行摇菌，然后使用质粒小量提取试剂盒说明书进行抽提质粒，最后用pacI酶切鉴定抽提的质粒，将重组成功质粒扩增；S4、腺病毒颗粒收集；S4.1、将生长状态好的293细胞按1:3传代；S4.2、第二天细胞生长达50％时，按FuGENE6TransfectionReagen转染试剂盒说明书将重组质粒转染293细胞；S4.3、6-8天后将细胞及上清反复冻融3次后离心，收集上清，再感染293细胞；S4.4、6-8天后收集细胞上清，使用过滤器过滤，分装冻存于-80℃冰箱。在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.1中，上游引物为5’-CTAGGGTACCATGCCGCGCGCTCCCCGCT-3’。在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.1中，下游引物为5’-CTAGAAGCTTTCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCT-3’。在一个优选地实施方式中，所述步骤S2.1中，涂氨苄霉素琼脂板后的11.5-12.5h内挑取单克隆。在一个优选地实施方式中，所述步骤S3.2中，涂氨苄抗性琼脂板后的11.5-12.5h内挑取10个菌落较小的单克隆。在一个优选地实施方式中，所述步骤S4.4中，过滤器采用微孔滤膜进行过滤，且微孔滤膜的过滤孔径为0.2μm-0.22μm。本专利技术的技术效果和优点：本专利技术通过pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建、BJ5183/p超级感受态的制备、同源重组腺病毒质粒构建以及腺病毒颗粒收集共四个步骤，能够稳定的获取腺病毒，且每次获取的腺病毒颗粒数都能够保持稳定，相比于现有技术中腺病毒的获取，获取效率以及稳定性都得到了很大的提高。附图说明图1为本专利技术的Pshuttle-cmv-hTERT双酶切鉴定图。图2为本专利技术的pAdEasy-1+pshuttle-cmv-hTERT同源重组质粒PacI酶切图。具体实施方式下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：本专利技术提供了一种腺病毒颗粒获得方法，具体操作步骤如下：S1、pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建；S1.1、根据NCBI(NM_198253.2)hTERT基因cDNA序列设计引物，引物包括上游引物和下游引物，上游引物为5’-CTAGGGTACCATGCCGCGCGCTCCCCGCT-3’，下游引物为5’-CTAGAAGCTTTCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCT-3’；S1.2、在上游引物添加HindIII酶切位点及保护碱基，在下游引物添加KpnI酶切位点保护碱基；S1.3、参照高保真DNA聚合酶PlatinumPfxDNAPolymerase说明书，采用PCR法特异性扩增hTERT基因编码序列，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到大小为3.3kb条带；S1.4、将限制性内切酶HindIII、KpnI双酶切hTERT和pshut本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种腺病毒颗粒获得方法，其特征在于：具体操作步骤如下：S1、pshuttle‑cmv‑hTERT穿梭质粒的构建；S1.1、根据NCBI hTERT基因cDNA序列设计引物，引物包括上游引物和下游引物；S1.2、在上游引物添加HindIII酶切位点及保护碱基，在下游引物添加KpnI酶切位点保护碱基；S1.3、参照高保真DNA聚合酶Platinum Pfx DNA Polymerase说明书，采用PCR法特异性扩增hTERT基因编码序列，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到大小为3.3kb条带；S1.4、将限制性内切酶HindIII、KpnI双酶切hTERT和pshuttle‑cmv进行酶切，得到酶切产物胶，回收后使用T4连接酶连接得到连接产物，接着将连接产物加入Trans‑T1感受态细胞中将其转化，然后使用质粒小量提取试剂盒说明书进行抽提质粒，最后用PmeI酶切鉴定抽提的质粒，将鉴定为阳性的质粒进行测序；S2、BJ5183/p超级感受态的制备；S2.1、采用热激法将质粒pAd‑Easy‑1转化成BJ5183感受态，然后涂氨苄霉素琼脂板，挑取单克隆；S2.2、采用Inoue方法制备含pAd‑Easy‑1的BJ5183超级感受态，命名为BJ5183/p；S3、同源重组腺病毒质粒构建；S3.1、用PmeI酶切pshuttle‑cmv‑TERT质粒使其线性化，然后采用热激法将其转化成超级感受态BJ5183/p；S3.2、涂氨苄抗性琼脂板，挑取10个菌落较小的单克隆，进行摇菌，然后使用质粒小量提取试剂盒说明书进行抽提质粒，最后用pacI酶切鉴定抽提的质粒，将重组成功质粒扩增；S4、腺病毒颗粒收集；S4.1、将生长状态好的293细胞按1:3传代；S4.2、第二天细胞生长达50％时，按FuGENE6 Transfection Reagen转染试剂盒说明书将重组质粒转染293细胞；S4.3、6‑8天后将细胞及上清反复冻融3次后离心，收集上清，再感染293细胞；S4.4、6‑8天后收集细胞上清，使用过滤器过滤，分装冻存于‑80℃冰箱。...
【技术特征摘要】
1.一种腺病毒颗粒获得方法，其特征在于：具体操作步骤如下：S1、pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建；S1.1、根据NCBIhTERT基因cDNA序列设计引物，引物包括上游引物和下游引物；S1.2、在上游引物添加HindIII酶切位点及保护碱基，在下游引物添加KpnI酶切位点保护碱基；S1.3、参照高保真DNA聚合酶PlatinumPfxDNAPolymerase说明书，采用PCR法特异性扩增hTERT基因编码序列，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到大小为3.3kb条带；S1.4、将限制性内切酶HindIII、KpnI双酶切hTERT和pshuttle-cmv进行酶切，得到酶切产物胶，回收后使用T4连接酶连接得到连接产物，接着将连接产物加入Trans-T1感受态细胞中将其转化，然后使用质粒小量提取试剂盒说明书进行抽提质粒，最后用PmeI酶切鉴定抽提的质粒，将鉴定为阳性的质粒进行测序；S2、BJ5183/p超级感受态的制备；S2.1、采用热激法将质粒pAd-Easy-1转化成BJ5183感受态，然后涂氨苄霉素琼脂板，挑取单克隆；S2.2、采用Inoue方法制备含pAd-Easy-1的BJ5183超级感受态，命名为BJ5183/p；S3、同源重组腺病毒质粒构建；S3.1、用PmeI酶切pshuttle-cmv-TERT质粒使其线性化，然后采用热激法将其转化成超级感受态BJ5183/p；S3.2、涂氨苄抗性琼脂板，挑取10个菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦晓东，何祥一，曾飒，张志东，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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