去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒及制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，去除天坛株溶瘤痘苗病毒VGF基因，表达EGFP基因，其中VGF基因的碱基序列如序列表1所示。本发明专利技术还公开了该去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法及应用。本发明专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒VTT‑VGFE，降低了天坛株溶瘤痘苗病毒的毒性，提高了天坛株溶瘤痘苗病毒的肿瘤选择性，且具有实时监测病毒颗粒在体内分布的功能，为痘苗病毒作为载体研发活疫苗及肿瘤生物治疗提供了良好工具，能够适用于治疗肺癌、肝癌、黑色素瘤等多种肿瘤。

Recombinant Tiantan Strain Oncolytic Vaccinia Virus Removing VGF Gene and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒及制备和应用
本专利技术属于生物基因工程
，涉及一种去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，本专利技术还涉及一种去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤生物治疗技术是近年来兴起的一种全新的肿瘤治疗手段，具有副作用小、抗肿瘤活性高、适应性广等特点。痘苗病毒(vacciniavirus,VACV)作为溶瘤病毒对肿瘤具有天然的趋向性，可选择性的感染肿瘤细胞，并在其内复制，不会被免疫系统很快清除。痘苗病毒天坛株(TianTanstrain,VTT)是我国特有的一株痘苗病毒，作为人类预防天花的疫苗，曾经在全世界范围内普遍使用，因此痘苗病毒为癌症治疗提供了新的方向。为了进一步提高痘苗病毒对肿瘤细胞的选择性，需要对病毒进行一定的改造。病毒生长因子(virusgrowthfactor,VGF)是一种与表皮生长因子同源的分泌型蛋白，可与细胞表面的表皮生长因子受体结合从而促进细胞增殖，这对病毒在正常组织中复制具有重要意义，但在肿瘤细胞中却可有可无，去除VTT的VGF基因可增强肿瘤选择性，提高病毒安全性。但是目前尚缺乏去除VGF基因的减毒天坛株病毒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒VTT-VGFE，能够降低天坛株溶瘤痘苗病毒的毒性，提高天坛株溶瘤痘苗病毒的肿瘤选择性。本专利技术还提供了去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法。及应用本专利技术所采用的技术方案是，去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，去除天坛株溶瘤痘苗病毒VGF基因，其中VGF基因的碱基序列如序列表1所示。本专利技术采用的第一种技术方案的特点在于：重组天坛株溶瘤痘苗病毒中插入了绿色荧光蛋白基因EGFP，绿色荧光蛋白基因EGFP由启动子子P7.5控制表达，绿色荧光蛋白基因EGFP位于重组天坛株溶瘤痘苗病毒的VGF区，绿色荧光蛋白基因EGFP的碱基序列如序列表2所示。重组天坛株溶瘤痘苗病毒的出发病毒为天坛株。本专利技术采用的另一种技术方案是：去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法，具体按照下述步骤进行：步骤1，将针对VTT病毒VGF基因的打靶质粒与VTT病毒在细胞内重组后，收集病毒；步骤2，筛选纯化重组病毒，得到去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒。本专利技术另一种技术方案的特点还在于：步骤1中针对VTT病毒VGF基因的打靶质粒为pMV-VTTVGFE，打靶质粒pMV-VTTVGFE含有出发载体pMV-Pro、痘苗病毒天坛株VGF基因的上游同源重组臂VTT-VGFL和下游同源重组臂VTT-VGFR，在VTT-VGFL与VTT-VGFR之间有荧光标记基因EGFP和1个多克隆位点，其中荧光标记基因EGFP由启动子P7.5控制表达，多克隆位点处包含启动子P11。步骤1具体按照下述步骤进行：步骤1.1，在T25细胞培养瓶中培养CV-1单层细胞，至70～80％覆盖；步骤1.2，用VTT病毒感染CV-1细胞，在37℃的温度下培养2～3小时；步骤1.3，将针对VTT病毒VGF基因的打靶质粒转染至感染了VTT病毒的CV-1细胞中，培养3～5小时后更换一次培养基；步骤1.4，将步骤1.3得到的CV-1细胞在培养箱继续培养48小时后，收集CV-1细胞，反复冻融三次，进行超声破碎，获得病毒悬液，并将其保存于-80℃的温度下。步骤2具体按照下述步骤进行：步骤2.1，在6孔板中培养CV-1细胞，至70～80％覆盖；步骤2.2，将步骤1收集的病毒悬液，做10倍倍比稀释后感染CV-1细胞，在37℃培养2～3小时；步骤2.3，在步骤2.2处理后的六孔板的每孔覆盖2～3ml琼脂DMEM培养基，培养2～3天；步骤2.4，将经过步骤2.3处理后的6孔板在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，挑取孤立的有绿色荧光的病毒噬斑进行连续单斑纯化，直至病毒纯化，得到去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒。去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒作为疫苗、生物载体和抗肿瘤药物的应用。本专利技术的有益效果是本专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒VTT-VGFE，降低了天坛株溶瘤痘苗病毒的毒性，提高了天坛株溶瘤痘苗病毒的肿瘤选择性，为痘苗病毒作为载体研发活疫苗及肿瘤生物治疗提供了良好工具，能够适用于治疗肺癌、肝癌、黑色素瘤等肿瘤。本专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒VTT-VGFE能够实现天坛株溶瘤痘苗病毒颗粒在体内分布的实时监测功能，可用于在活体水平上研究病毒与宿主细胞的作用。附图说明图1是本专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法中打靶质粒pMV-VTTVGFE的图谱；图2是本专利技术产生的噬斑图，图2A为去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒在明场下的噬斑图；图2B为本专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒在暗场下的绿色荧光噬斑图；图3是本专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的VGF区PCR鉴定图；图4是本专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒毒性试验中1×105PFU/只/200μl剂量下的小鼠的生存曲线图；图5是本专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒毒性试验中1×104PFU/只/200μl剂量下的小鼠的生存曲线图；图6是本专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒对肿瘤细胞的杀伤力实验中，VTT-VGFE和VTT对肺癌细胞A549的杀伤力情况对比图；图7是本专利技术去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒对肿瘤细胞的杀伤力实验中，VTT-VGFE病毒和VTT对肝癌细胞HepG2的杀伤力情况对比图。具体实施方式下面结合附图以及具体实施方式对本专利技术进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本专利技术中野生痘苗病毒天坛株的DNA序列为GenBank号为AF095689.1的序列(VRL14-FEB-2000)。以下实施例中的野生型痘苗病毒天坛株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室(本实验室，下同)保藏。pMV-VTTVGFE质粒由本实验室保藏；细胞系CV-1、A549、HepG2购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。主要试剂和材料：DMEM、胎牛血清购自hyclone公司，脂质体lipofectamine2000转染试剂购自Invitrogen公司，病毒基因组提取试剂盒购自Biomiga公司，2×PCRMix试剂和质粒提取试剂盒购自天根生化科技公司，Balb/cNude小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。一，去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法，具体按照下述步骤进行：步骤1，将针对VTT病毒VGF基因的打靶质粒与VTT病毒在细胞内重组后，收集病毒：步骤1.1，在T25细胞培养瓶中培养CV-1单层细胞，至70～80％覆盖；步骤1.2，用VTT病毒感染CV-1细胞，在37℃的温度下培养2～3小时；步骤1.3，将针对VTT病毒VGF基因的打靶质粒转染至感染了VTT病毒的CV-1细胞，培养3～5小时后更换一次培养基；步骤1.4，将步骤1.3得到的CV-1细胞在培养箱继续培养48小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，去除天坛株溶瘤痘苗病毒VGF基因，其中VGF基因的碱基序列如序列表1所示。

【技术特征摘要】
1.去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，去除天坛株溶瘤痘苗病毒VGF基因，其中VGF基因的碱基序列如序列表1所示。2.根据权利要求1所述的去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，所述重组天坛株溶瘤痘苗病毒中插入了绿色荧光蛋白基因EGFP，所述绿色荧光蛋白基因EGFP由启动子P7.5控制表达，所述绿色荧光蛋白基因EGFP位于重组天坛株溶瘤痘苗病毒的VGF区，所述绿色荧光蛋白基因EGFP的碱基序列如序列表2所示。3.根据权利要求1所述的去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，所述重组天坛株溶瘤痘苗病毒的出发病毒为天坛株。4.去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：步骤1，将针对VTT病毒VGF基因的打靶质粒与VTT病毒在细胞内重组后，收集病毒；步骤2，筛选纯化重组病毒，得到去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒。5.根据权利要求4所述的去除VGF基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤1中针对VTT病毒VGF基因的打靶质粒为pMV-VTTVGFE，所述打靶质粒pMV-VTTVGFE含有出发载体pMV-Pro、痘苗病毒天坛株VGF基因的上游同源重组臂VTT-VGFL和下游同源重组臂VTT-VGFR，在VTT-VGFL与VTT-VGFR之间有荧光标记基因EGFP和1个多克隆位点，其中荧光标记基因EGFP由启...

【专利技术属性】
技术研发人员：马茜，汪洋，
申请(专利权)人：西安彤盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61