基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用制造技术

本发明专利技术涉及可作为疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法。本发明专利技术采用非洲猪瘟中国流行株Pig/CN/HLJ/2018，经基因工程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得MGF360‑505R缺失和CD2V与MGF360‑505R联合缺失的基因缺失病毒。经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。

Attenuated African Swine Fever Virus with Gene Deletion and Its Application as Vaccine

【技术实现步骤摘要】
基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用
本专利技术涉及兽医领域，具体为动物疾病预防和治疗，更具体涉及减毒的非洲猪瘟病毒和疫苗。
技术介绍
非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)家族的唯一成员，并且主要在细胞的细胞质中复制。非洲猪瘟是家猪和野猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病，强毒株可在感染的约5-14天内杀死家猪，其中死亡率接近100％，无有效预防疫苗，无特效治疗药物。各阶段家猪、野猪和软蜱是非洲猪瘟自然宿主，可在家猪和野猪之间直接传播，也可通过蜱虫叮咬传播，还可以通过污染了病毒的泔水、饲料以及腌制的干火腿等猪肉产品跨国家和地区传播。发现疫情，必须进行扑杀，是全球防范内危害猪群最严重的传染病之一，是我国重点防范的头号外来动物疫病。我国生猪养殖占世界50％以上。周边国家疫情国家逐年增多，存在自然疫病病源地。根据国外非洲猪瘟疫净化根除历史看，一旦发生非洲猪瘟疫情，要彻底根除，均需要花费漫长的时间，并付出重大的代价。因此，必须加快开展非洲猪瘟流行病学、相关致病机制、快速诊断检测技术产品和防治疫苗的研究，并做好长期应对复杂的非洲猪瘟疫情防控的技术和政策部署。根据我国国情和已有病毒病防控经验，疫苗是防控非洲猪瘟疫情最为有效和经济的方法，研制有效、安全的疫苗十分迫切。非洲猪瘟病毒自从发现100多年来，采用传统疫苗研制策略[Forman，A.J.，R.C.Wardley，andP.J.Wilkinson，TheimmunologicalresponseofpigsandguineapigstoantigensofAfricanswinefevervirus.ArchVirol，1982.74(2-3)：p.91-100；Mebus，C.A.，Africanswinefever.AdvVirusRes，1988.35：p.251-69；Stone，S.S.andW.R.Hess，AntibodyresponsetoinactivatedpreparationsofAfricanswinefevervirusinpigs.AmJVetRes，1967.28(123)：p.475-81.](包括灭活疫苗、自然弱毒或传代致弱疫苗等)、新型佐剂[Blome，S.，C.Gabriel，andM.Beer，ModernadjuvantsdonotenhancetheefficacyofaninactivatedAfricanswinefevervirusvaccinepreparation.Vaccine，2014.32(31)：p.3879-82.]和亚单位疫苗等新型疫苗[Jancovich，J.K.，etal.，ImmunizationofPigsbyDNAPrimeandRecombinantVacciniaVirusBoostToIdentifyandRankAfricanSwineFeverVirusImmunogenicandProtectiveProteins.JVirol，2018.92(8)；Gomez-Puertas，P.，etal.，TheAfricanswinefevervirusproteinsp54andp30areinvolvedintwodistinctstepsofvirusattachmentandbothcontributetotheantibody-mediatedprotectiveimmuneresponse.Virology，1998.243(2)：p.461-71；Neilan，J.G.，etal.，NeutralizingantibodiestoAfricanswinefevervirusproteinsp30，p54，andp72arenotsufficientforantibody-mediatedprotection.Virology，2004.319(2)：p.337-42；Ruiz-Gonzalvo，F.，F.Rodriguez，andJ.M.Escribano，Functionalandimmunologicalpropertiesofthebaculovirus-expressedhemagglutininofAfricanswinefevervirus.Virology，1996.218(1)：p.285-9；Lacasta，A.，etal.，ExpressionlibraryimmunizationcanconferprotectionagainstlethalchallengewithAfricanswinefevervirus.JVirol，2014.88(22)：p.13322-32.]等研制策略，均未成功，使得该疫病多年来到处肆掠，从非洲向全世界范围蔓延。紧靠扑杀策略，仅仅有西班牙、巴西等屈指可数的国家成功控制住非洲猪瘟。但由于我国猪饲养量巨大，仅仅靠扑杀手段，成本太高，安全、有效的疫苗是控制我国非洲猪瘟疫情的迫切需求！目前，通过基因缺失致弱成为非洲猪瘟疫苗研究重要的方向。非洲猪瘟是由双链DNA病毒，基因组较大，基因型众多(24个基因型)[Quembo，C.J.，etal.，GeneticcharacterizationofAfricanswinefevervirusisolatesfromsoftticksatthewildlife/domesticinterfaceinMozambiqueandidentificationofanovelgenotype.TransboundEmergDis，2018.65(2)：p.420-431.]，编码150-167种蛋白，免疫逃逸机制复杂，一般是由多个毒力基因共同发挥作用，这就导致不同基因型之间的生物学特性差异较大，不同基因型之间交叉免疫保护能力较差[Souto，R.，etal.，VaccinePotentialofTwoPreviouslyUncharacterizedAfricanSwineFeverVirusIsolatesfromSouthernAfricaandHeterologousCrossProtectionofanAvirulentEuropeanIsolate.TransboundEmergDis，2016.63(2)：p.224-31；King，K.，etal.，ProtectionofEuropeandomesticpigsfromvirulentAfricanisolatesofAfricanswinefevervirusbyexperimentalimmunisation.Vaccine，2011.29(28)：p.4593-600.]。在CN106459931A中公开了缺失以下基因的功能性形式的减毒的非洲猪瘟病毒：多基因家族360基因9L，10L，11L，12L，13L和14L；和多基因家族505基因1R，2R，3R和4R，还提供了缺乏DP148R基因的功能性形式的减毒非洲猪瘟病毒。并探讨了不同施药方式如如通过肌内注射肌肉注射、鼻内和口服等。在US9474797B1中，给出非洲猪瘟病毒ASF-GVAV的全长DNA序列，其中对位置为17864本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒，其特征在于，将基因I型的非洲猪瘟病毒的MGF360‑505R基因缺失病毒，或CD2V与MGF360‑505R基因联合缺失病毒，所述基因I型的非洲猪瘟病毒是全长基因组序列如GenBank:MK333180.1中所述的中国流行株Pig/CN/HLJ/2018。

【技术特征摘要】
1.一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒，其特征在于，将基因I型的非洲猪瘟病毒的MGF360-505R基因缺失病毒，或CD2V与MGF360-505R基因联合缺失病毒，所述基因I型的非洲猪瘟病毒是全长基因组序列如GenBank:MK333180.1中所述的中国流行株Pig/CN/HLJ/2018。2.根据权利要求1所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒，其特征在于，所述MGF360-505R基因缺失病毒相对于原始毒株全长序列缺失了第27942-35500位核苷酸。3.根据权利要求2所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒，其特征在于，所述MGF360-505R基因缺失病毒，保藏号为CCTCCNO:V201925。4.根据权利要求1所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒，其特征在于，所述CD2V与MGF360-505R基因联合缺失病毒相对于原始毒株全...

【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，陈伟业，赵东明，何希君，刘任强，柳金雄，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23