重组溶瘤腺病毒Onco制造技术

本发明专利技术公开了一种重组溶瘤腺病毒Onco

Recombinant oncolytic adenovirus Onco

【技术实现步骤摘要】
重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体地说，是关于一种重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用。
技术介绍
肝癌是全球第五大常见的恶性肿瘤，具有高发病率和死亡率的特点，在肿瘤致死原因中排第三位，严重危害人类的生命健康和安全。肝癌的发病机制复杂，尚未完全清楚。目前临床上治疗肝癌一般采用介入治疗、化疗、外科手术、放疗及联合治疗等方式，这些传统方式主要表现在治愈率低、复发率及死亡率高、预后较差。对于中晚期的癌症患者来说，这些传统的方法难以奏效，急需新的治疗手段来延长患者的生命，提高他们的生活质量。全球肝癌统计数据发现，男性的肝癌发生率要高于女性，在发展中国家，肝癌致死率排名第二，而我国的肝癌发生率和死亡率占全球的一半，因此，我们亟需寻找新的癌症治疗方法。靶向基因-病毒治疗策略，以溶瘤病毒为载体，携带抗癌基因，利用其在肿瘤细胞内特异性增殖，裂解，成千上万倍的提高抗癌基因的表达量。该策略克服了基因治疗靶向性低，转染效率低等的缺点，充分利用溶瘤病毒复制转移能力强，体积小的优势，进一步提高抗肿瘤的效果。中国专利文献CN103981185A公开了一种肝癌特异性GP73核心启动子，通过筛选该启动子具有高效的肝癌特异性，同时，该文献还公开了携带GP73启动子靶向肝癌腺病毒载体GD55的构建和应用，所获得的双靶向腺病毒GD55-gene溶瘤腺病毒能选择性的杀死肿瘤细胞，而不影响正常细胞，因此能有效地抑制肿瘤生长，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台。为此，专利技术人尝试开发新的靶向药物，以期获得更高效和更稳定的疗效，为肝癌的治疗找到新的方向和启示。P28GANK又称P28，Gankyri，PSMD10，是一种由226个氨基酸组成，分子量为25kDa的蛋白质。经研究，这种蛋白是人26S蛋白酶体调节亚单位19S/PA700复合物中的一种非ATP酶亚基。最初，P28GANK是通过cDNA文库经过消减杂交法克隆而得到的一个在肝癌细胞中差异表达的基因，P28GANK蛋白在哺乳动物中高度保守，它能介导蛋白质与蛋白质之间的相互作用，从而发挥多种生物学功能。P28GANK基因在肝癌细胞中呈特异性的高表达状态，Fujita等人对肝癌患者样品进行mRNA表达检测，发现P28GANK的mRNA的表达水平在肝癌组织中比癌旁组织高出3.4倍(Higashitsuji,H.,etal.,Reducedstabilityofretinoblastomaproteinbygankyrin,anoncogenicankyrin-repeatproteinoverexpressedinhepatomas.NatMed,2000.6(1):p.96-9)。王红阳等对64例肝癌样本进行了Northernblot检测，结果显示，P28GANK在肝癌细胞中检出率高达96.9％，表达明显升高的样本占了91.9％，P28GANK蛋白同时在肝硬化组织中也有一定水平的表达，但是在正常的细胞中，没有检出P28GANK的表达。同时王红阳等在HepG2、HuH-7、SK-Hep-1、Hep3四种肝癌细胞中均检测到了该基因的高表达(Fu,X.Y.,etal.,Overexpressionofp28/gankyrininhumanhepatocellularcarcinomaanditsclinicalsignificance.WorldJGastroenterol,2002.8(4):p.638-43)。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。本专利技术的第二个目的是提供一种所述重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供一种所述重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B在制备治疗肝癌药物中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种治疗肝癌的药物组合物。本专利技术的第五个目的是筛选一种肝癌特异性P28GANK启动子，以获得一种高靶向性和高特异性的携带P28GANK启动子的核心序列的溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台。本专利技术的第六个目的是提供一种所述肝癌特异性P28GANK启动子的筛选方法。本专利技术的第七个目的是提供一种所述肝癌特异性P28GANK启动子在制备治疗肝癌药物中的应用。本专利技术克隆了P28GANK蛋白的启动子序列，通过体外Dual-Luciferase双荧光检测系统，对其启动子活性进行了检测，筛选出了启动子活性较高的长度为196bp的核心序列。接着，用筛选出的P28GANK启动子替换了腺病毒内源的E1A启动子，构建了肝癌特异性启动子P28GANK调控E1A区，同时，敲除腺病毒基因组E1B基因区域，获得重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。并通过实验研究发现，与对照组GP73启动子控制的溶瘤腺病毒相比，重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-△E1B杀伤肝癌细胞的能力显著增强，同时，对正常的肝细胞QSG-7701几乎不存在毒性。为此，专利技术人尝试开发新的靶向药物，以期获得更高效和更稳定的疗效，为肝癌的治疗找到新的方向和启示。基于以上目的，本专利技术的第一个方面，提供一种重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B，该重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-△E1B由SEQIDNO：19所示的P28GANK启动子替换了腺病毒内源的E1A启动子，构建了肝癌特异性启动子P28GANK调控E1A区，同时，敲除腺病毒基因组E1B基因区域。本专利技术的第二个方面，提供了所述重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B的构建方法，包括以下步骤：步骤一、以PGL3-F4(+1/-194)质粒为模板，采用如SEQIDNO：8和SEQIDNO：9所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点Xhol到SnabI的核酸片段，即P28GANK启动子片段；步骤二、以pZXC2质粒为模板，采用如SEQIDNO：12和SEQIDNO：13所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点SnabI到Xbal的核酸片段，即P-E1A基因片段；步骤三、以步骤一的P28GANK启动子片段和步骤二的P-E1A基因片段为模板，采用如SEQIDNO：8和SEQIDNO：13所示的特异性引物，进行OverlapPCR，得到一段从酶切位点Xhol到Xbal的核酸片段，即P28GANK-E1A片段；步骤四、将OverlapPCR得到的P28GANK-E1A片段用XhoI和XbaI双酶切，然后与同样用XhoI和XbaI双酶切的pShuttle-sur-E1A-△E1B质粒相连接，得到pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B；步骤五、将构建好的pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B重组质粒用限制性内切酶PmeI线性化，去磷后转化到带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-E3的BJ5183感受态中，使二者发生同源重组，筛选并获得阳性重组克隆的腺病毒质粒；步骤六本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组溶瘤腺病毒Onco

【技术特征摘要】
1.一种重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B，其特征在于，所述重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B如SEQIDNO：19所示的P28GANK启动子替换了腺病毒内源的E1A启动子，构建了肝癌特异性启动子P28GANK调控E1A区，同时，腺病毒基因组敲除了E1B基因区域。2.一种如权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、以PGL3-F4质粒为模板，采用如SEQIDNO：8和SEQIDNO：9所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点Xhol到SnabI的核酸片段，即P28GANK启动子片段；步骤二、以pZXC2质粒为模板，采用如SEQIDNO：12和SEQIDNO：13所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点SnabI到Xbal的核酸片段，即P-E1A基因片段；步骤三、以步骤一的P28GANK启动子片段和步骤二的P-E1A基因片段为模板，采用如SEQIDNO：8和SEQIDNO：13所示的特异性引物，进行OverlapPCR，得到一段从酶切位点Xhol到Xbal的核酸片段，即P28GANK-E1A片段；步骤四、将OverlapPCR得到的P28GANK-E1A片段用XhoI和XbaI双酶切，然后与同样用XhoI和XbaI双酶切的pShuttle-pSur-E1A-△E1B质粒相连接，得到pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B；步骤五、将构建好的pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B重组质粒用限制性内切酶PmeI线性化，去磷后转化到带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-E3的BJ5183感受态中，使二者发生同源重组，筛选并获得阳性重组克隆的腺病毒质粒；步骤六、将阳性重组克隆的腺病毒质粒用限制性内切酶PacI线性化，转染入人胚胎肾细胞株HEK-293，获得重组溶瘤腺病毒OncoAd-...

【专利技术属性】
技术研发人员：章康健，刘新垣，方先龙，顾锦法，
申请(专利权)人：上海元宋生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31