一种重组溶瘤基因腺病毒及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种重组溶瘤基因腺病毒及其构建方法与应用。所述的重组溶瘤基因腺病毒的启动子包括肝癌特异性启动子，所述的重组溶瘤基因腺病毒包括IL

【技术实现步骤摘要】
一种重组溶瘤基因腺病毒及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于重组溶瘤基因-腺病毒
，具体涉及一种重组溶瘤基因腺病毒及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]癌症严重影响人类的健康和发展，受医疗和环境条件的影响，中国癌症死亡率高于全球平均水平。肿瘤的传统疗法存在疗效差，死亡率高及预后复发率高等缺点，因此人们开始对新兴的肿瘤治疗方法寄予厚望。新兴的治疗肿瘤的策略也在不断的发展之中，目前比较被认同的策略包括免疫疗法，基因疗法，溶瘤病毒疗法等。目前的各种基因载体并不能够在人体内特异性选择肿瘤细胞，也不能在肿瘤细胞中高效表达抗癌基因，从而导致基因治疗的效果较弱和误伤人体正常细胞的可能性。仅仅使用基因治疗或者特异性靶向肿瘤的病毒治疗癌症，其效果都十分有限。
[0003]因此，有必要提供改进的技术方案以克服现有技术中存在的技术问题。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种重组溶瘤基因腺病毒及其构建方法与应用，所述的重组溶瘤基因腺病毒具有高效的癌症特异性，用其构建获得的重组溶瘤腺病毒对正常细胞的毒性低、杀伤癌细胞效果好，且与BRD4抑制剂联用具有协同作用，抗癌效果优于一般的重组溶瘤腺病毒。
[0005]本专利技术第一方面提供一种重组溶瘤基因腺病毒，所述的重组溶瘤基因腺病毒的启动子包括肝癌特异性启动子，所述的重组溶瘤基因腺病毒包括IL-24的编码核苷酸序列。通过该技术步骤，得到的重组溶瘤基因腺病毒对正常细胞的毒性低、杀伤肝癌细胞效果好，靶向抗癌效果优于一般的重组溶瘤腺病毒。
[0006]优选地，所述的重组溶瘤基因腺病毒的启动子包括P28GANK启动子，所述的重组溶瘤基因腺病毒的基因组敲除了E1B基因区域。通过该技术步骤的处理，增强了重组溶瘤基因腺病毒的肝癌靶向性，提高了重组溶瘤基因腺病毒的外源基因装载容量。
[0007]本专利技术第二方面提供一种重组溶瘤基因腺病毒的构建方法，所述的构建方法包括以下步骤：步骤一、重组小质粒的构建：以含IL-24表达框的质粒为模板进行PCR，克隆得到IL-24的表达框；再以限制性内切酶单酶切pShuttle-P28-E1A-ΔE1B小质粒并进行去磷处理，得到线性化并去磷的pShuttle-P28-E1A-ΔE1B小质粒，连接所述IL-24的表达框和线性化并去磷的pShuttle-P28-E1A-ΔE1B小质粒，得到重组小质粒pShuttle-P28-E1A-ΔE1B-IL-24；步骤二、重组大质粒的构建：将步骤一构建的所述pShuttle-P28-E1A-ΔE1B-IL-24小质粒用限制性内切酶线性化，去磷后转入带有腺病毒骨架质粒的大肠杆菌感受态中，使二者发生同源重组，筛选获得阳性克隆，得到重组大质粒；
步骤三、重组溶瘤腺病毒的包装：将步骤二得到的重组大质粒使用限制性内切酶线性化，转染细胞，转染时间不少于3天，收取病毒液。
[0008]专利技术人通过上述技术步骤，构建了包括IL-24的编码核苷酸序列的重组溶瘤基因腺病毒，可实现对肝癌细胞的特异性杀伤，靶向抗癌效果优于一般的重组溶瘤腺病毒。
[0009]优选地，在所述的构建方法中，步骤三所述的细胞为HEK293细胞，转染时间不少于5天，所述的收取病毒液的方法包括：将步骤三转染后的细胞及其培养液反复冻融，离心得到的上清液，即为病毒液。该技术步骤的参数设置通过HEK293细胞收取的包括IL-24的编码核苷酸序列的重组溶瘤基因腺病毒病毒含量提高了至少100%，病变时间缩短了至少20%，实现重组溶瘤基因腺病毒的快速高效包装。
[0010]本专利技术第三方面提供一种重组溶瘤基因腺病毒在癌症治疗药物中的应用，所述的重组溶瘤基因腺病毒为OncoAd-P28-E1A-ΔE1B-IL-24。
[0011]优选地，在所述的应用中，所述的重组溶瘤基因腺病毒还包括OncoAd-P28-E1A-ΔE1B。
[0012]优选地，在所述的应用中，所述的癌症治疗药物还包括BRD4特异性的抑制剂。该技术步骤，将BRD4抑制剂作为一种联用药物，与重组溶瘤基因腺病毒联用具有协同抗癌作用，抗癌效果显著优于重组溶瘤基因腺病毒或者BRD4抑制剂的单用药。
[0013]优选地，在所述的应用中，所述的重组溶瘤基因腺病毒的启动子包括肝癌特异性启动子，所述的重组溶瘤基因腺病毒包括IL-24的编码核苷酸序列。通过该技术步骤，可实现技术效果为：重组溶瘤基因腺病毒对正常细胞的毒性低、杀伤肝癌细胞效果好，靶向抗癌效果优于一般的重组溶瘤腺病毒。
[0014]优选地，在所述的应用中，所述的重组溶瘤基因腺病毒的启动子包括P28GANK启动子，所述的重组溶瘤基因腺病毒的基因组敲除了E1B基因区域。通过该技术步骤，可实现技术效果为：增强了重组溶瘤基因腺病毒的肝癌靶向性，提高了重组溶瘤基因腺病毒的外源基因装载容量。
[0015]优选地，在所述的应用中，所述的BRD4特异性的抑制剂包括JQ-1、PFI-1、MS645中的一种或几种。
[0016]本专利技术创造的有益效果：本专利技术提供一种重组溶瘤基因腺病毒具有高效的癌症特异性，用其构建获得的重组溶瘤腺病毒对正常细胞的毒性低、杀伤癌细胞效果好，且与BRD4抑制剂联用具有协同作用，抗癌效果优于一般的重组溶瘤腺病毒。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0018]图1为重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28-E1A-ΔE1B-IL-24及其相应空载病毒结构模式图；图2为PCR扩增IL-24表达框和线性化pShuttle-P28-E1A-ΔE1B小质粒；
图3为重组大质粒MluI酶切鉴定；图4为PCR鉴定IL-24基因和P28启动子；图5为PCR 鉴定E1A野生型启动子和E1B区；图6为WB检测重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28-E1A-ΔE1B-IL-24中所携带治疗基因的表达；图7为结晶紫法检测重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28-E1A-ΔE1B-IL-24对肝癌细胞的靶向杀伤；图8为CCK-8法检测重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28-E1A-ΔE1B-IL-24对肝癌细胞的靶向杀伤；图9为CCK8显示重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28-E1A-ΔE1B-IL-24与JQ1联用具有协同作用；图10为Hoechst染色显示重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28-E1A-ΔE1B-IL-24与JQ1联用具有协同作用；图11为流式分析显示重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28-E1A-ΔE1B-IL-24与JQ1联用具有协同作用；图12为CCK8显示重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28-E1A-ΔE1B-IL-24与PFI-1、MS645联用均具有协同作用；图13为JQ1促进重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28-E1A-ΔE1B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组溶瘤基因腺病毒，其特征在于，所述的重组溶瘤基因腺病毒的启动子包括肝癌特异性启动子，所述的重组溶瘤基因腺病毒包括IL-24的编码核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组溶瘤基因腺病毒，其特征在于，所述的重组溶瘤基因腺病毒的启动子包括P28GANK启动子，所述的重组溶瘤基因腺病毒的基因组敲除了E1B基因区域。3.一种权利要求1或2所述的重组溶瘤基因腺病毒的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括以下步骤：步骤一、重组小质粒的构建：以含IL-24表达框的质粒为模板进行PCR，克隆得到IL-24的表达框；再以限制性内切酶单酶切pShuttle-P28-E1A-ΔE1B小质粒并进行去磷处理，得到线性化并去磷的pShuttle-P28-E1A-ΔE1B小质粒，连接所述IL-24的表达框和线性化并去磷的pShuttle-P28-E1A-ΔE1B小质粒，得到重组小质粒pShuttle-P28-E1A-ΔE1B-IL-24；步骤二、重组大质粒的构建：将步骤一构建的所述pShuttle-P28-E1A-ΔE1B-IL-24小质粒用限制性内切酶线性化，去磷后转入带有腺病毒骨架质粒的大肠杆菌感受态中，使二者发生同源重组，筛选获得阳性克隆，得到重组大质粒；步骤三、重组溶瘤腺病毒的...

【专利技术属性】
技术研发人员：方先龙，章康健，曹雪萍，顾锦法，刘新垣，
申请(专利权)人：上海元宋生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：