一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一种腺病毒包装与生产的细胞系

【技术实现步骤摘要】
一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及其应用，尤其涉及一种包含修饰的
E1
区的腺病毒包装与生产细胞系的构建及其应用
。

技术介绍

[0002]现在被广泛用于腺病毒大规模生产的细胞系为
HEK293
细胞系
。
由于其基因组中含有多拷贝数的野生型腺病毒的
E1
区基因片段，能自发的高水平表达腺病毒复制所必须的
E1
区基因编码蛋白
。E1
区基因编码蛋白为
E1A
和
E1B
，主要功能有：促进和调节腺病毒基因组后续有关基因的表达；调节细胞周期为溶瘤腺病毒的包装和复制创造条件；抑制细胞凋亡以提高病毒单产
。
并且
HEK293
为腺病毒易感型细胞，因此被广泛运用于腺病毒的包装和生产领域
。
[0003]HEK293
细胞虽然有高产
、
易培养
、
生长速度快等优点，但由于
HEK293
基因组中存在多拷贝数的野生型腺病毒
E1
区基因片段，经
E1
区修饰的腺病毒在
HEK293
细胞中包装和生产时，会不可避免地通过同源重组而产生野生型
E1
区的腺病毒，且随着扩增代次的增加，野生型
E1
区的腺病毒比例会显著上升，严重影响经
>E1
区修饰的腺病毒的质量，且很难通过现有技术手段将其从目的产物中分离去除
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的专利技术人在研究中意外发现，利用
CRISPR/Cas9
基因编辑技术，将序列修饰后的腺病毒
E1
区序列定点整合至对腺病毒易感的细胞系
(
例如，癌细胞系
HeLa S3)
的基因组中，由此获得的细胞系能稳定表达腺病毒复制包装所需的
E1
区蛋白，同时所述修饰后的
E1
区可避免通过同源重组产生包含野生型
E1
区腺病毒的可能性
。
与经典的腺病毒生产细胞
HEK293
细胞相比，本专利技术在不降低腺病毒产量的前提下，完全解决了腺病毒在包装与生产过程中通过同源重组产生包含野生型
E1
区的腺病毒的问题
。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供以下技术方案
。
[0006]本专利技术的第一个方面，提供一种腺病毒包装与生产细胞，其中所述细胞的基因组包含改造的腺病毒
E1
区序列，所述改造的腺病毒
E1
区序列与野生型
E1
区序列相比：
1)
野生型
E1
区序列的低频密码子被所述细胞中最优的同义密码子替换；
2)
碱基重复减少；
3)
避免野生型
E1
区序列中的一些限制酶识别位点；
4)GC
含量提高；
5)
避免转录获得的
mRNA
具有二级结构；
6)
避免密码子重复导致的长重复序列；所述改造的腺病毒
E1
区序列编码的蛋白具有与野生型
E1A
和
E1B
蛋白相同的功能，优选地，所述改造的腺病毒
E1
区序列编码的蛋白具有与野生型
E1A
和
E1B
蛋白相同的氨基酸序列
。
[0007]在本专利技术的一些实施方案中，所述改造的腺病毒
E1
区序列还包含启动子，所述启动子位于
E1
区编码序列上游，能够启动
E1
区基因的表达
。
现有技术已知的启动子均可用于本专利技术，只要能启动
E1
区基因在宿主细胞的表达即可
。
优选地，所述启动子选自
SV40
启动子和
mPGK
启动子
。
[0008]在本专利技术的另一些实施方案中，所述改造的腺病毒
E1
区序列选自
SEQ ID NO:2
和
SEQ ID NO:4
‑7，优选为
SEQ ID NO:2。
[0009]在本专利技术的另一些实施方案中，所述细胞为能进行腺病毒包装与生产细胞的人源细胞，例如来源于
A549、A375、HeLa、SW620、22RV1、MDA
‑
MB
‑
435S、ES
‑2或
HCC1806
细胞，优选为
HeLa S3
细胞
。HeLa S3
细胞的基因组中不含有野生型腺病毒的部分基因组，例如
E1
区，因此不会通过重组产生野生型腺病毒，此外，
HeLa S3
细胞跟其他病毒易感细胞相比，具有扩增速度快
、
单细胞产量高的优势
。
[0010]在本专利技术的另一些实施方案中，所述改造的腺病毒
E1
区序列在所述细胞基因组中的插入位点选自
AAVS1、CCR5、ROSA26、LMO2、CCDN2、BMI1\MECOM\PRDM1、H11、HBB03、HBB04、FANCF02、RUNX1
和
ZSCAN2
，优选为
AAVS1
位点
。
现有技术已知的其它位点也可用于本专利技术，这些位点可
[0011]在本专利技术的另一些实施方案中，所述细胞能够包装与生产复制缺陷型腺病毒和复制型腺病毒，在复制型腺病毒连续传代时不产生野生型腺病毒
。
[0012]本专利技术的第二个方面，提供一种构建如第一个方面所述的腺病毒包装与生产细胞的方法，包括：
[0013]对野生型
E1
区序列进行改造，获得改造的腺病毒
E1
区序列；
[0014]将所述改造的腺病毒
E1
区序列插入宿主细胞基因组；
[0015]其中，所述改造的腺病毒
E1
区序列与野生型
E1
区序列相比：
1)
野生型
E1
区序列的低频密码子被所述细胞中最优的同义密码子替换；
2)
碱基重复减少；
3)
避免野生型
E1
区序列中的一些限制酶识别位点；
4)GC
含量提高；
5)
避免转录获得的
mRNA
具有二级结构；
6)
避免密码子重复导致的长重复序列；所述改造的腺病毒
E1
区序列编码的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种腺病毒包装与生产细胞，其中所述细胞的基因组包含改造的腺病毒
E1
区序列，所述改造的腺病毒
E1
区序列与野生型
E1
区序列相比：
1)
野生型
E1
区序列中的低频密码子被所述细胞中最优的同义密码子替换；
2)
碱基重复减少；
3)
避免野生型
E1
区序列中的一些限制酶识别位点；
4)GC
含量提高；
5)
避免转录获得的
mRNA
具有二级结构；
6)
避免密码子重复导致的长重复序列；所述改造的腺病毒
E1
区序列编码的蛋白具有与野生型
E1A
和
E1B
蛋白相同的功能，优选地，所述改造的腺病毒
E1
区序列编码的蛋白具有与野生型
E1A
和
E1B
蛋白相同的氨基酸序列
。2.
如权利要求1所述的细胞，其中所述改造的腺病毒
E1
区序列选自
SEQ ID NO:2
和
SEQ ID NO:4
‑
7。3.
如权利要求2所述的细胞，其中所述改造的腺病毒
E1
区序列为
SEQ ID NO:2。4.
如权利要求1‑3任一所述的细胞，其中所述改造的腺病毒
E1
区序列还包含启动子，优选地，所述启动子选自
SV40
启动子和
mPGK
启动子
。5.
如权利要求1‑4任一所述的细胞，其中所述细胞是人源细胞
。6.
如权利要求5所述的细胞，其中所述细胞选自来源于
A549、A375、HeLa、SW620、22RV1、MDA
‑
MB
‑
435S、ES
‑2和
HCC1806
细胞
。7.
如权利要求6所述的细胞，其中所述细胞为
HeLa S3
细胞
。8.
如权利要求1‑7任一所述的细胞，其中所述改造的腺病毒
E1
区序列在所述细胞基因组中的插入位点选自
AAV...

【专利技术属性】
技术研发人员：方先龙，章康健，曹雪萍，顾锦法，张婷婷，王立申，
申请(专利权)人：上海元宋生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：