一种靶向制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CD38的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医疗
，具体涉及一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法及其应用
。

技术介绍

[0002]随着年龄的增长，细胞和组织的活力
、
适应性和再生能力逐渐下降，组织结构不断损害
、
机体功能逐渐衰退，器官慢性退行性变的发生风险也随之增加
。
尽管组织退行性变不被归类为疾病，但由于退行性变是癌症
、
糖尿病
、
心血管和神经退行性疾病等疾病的主要危险因素，其不仅影响老年人的健康和生活质量，也给社会和经济带来沉重负担，因此，有效维持组织的稳态和延缓衰老相关表型发生的方法仍然是临床上的重大挑战
。
[0003]CD38
是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有环化酶和水解酶的活性，是一种双功能胞外酶，参与核苷酸代谢，调节细胞质中
Ca2+
的动员，激活控制各种生物学过程的信号通路
。CD38
在人多种组织中都有表达，包括淋巴细胞
、
自然杀伤细胞
、T
细胞
、B
细胞单核细胞
/
巨噬细胞胰腺
、
脑
、
脾脏和肝细胞等
。
随着细胞的衰老，代谢负担逐渐加重，衰老细胞及其分泌的信号会引发
CD38
的激活，进而导致
NAD+
的降解，消耗
NAD+
的含量
。NAD+
广泛分布在人体所有细胞当中，是人最重要的辅酶之一，尤其是对调节细胞衰老和维持机体正常功能至关重要
。
初步的研究数据表明，在老年动物中阻断
CD38
的活性可以恢复特定组织中的
NAD+
水平
。
故而，靶向
CD38
的药物或可成为防止人体
NAD+
的下降的新治疗方法，从而抵抗衰老
。
因此，
CD38
是衰老中的一个关键靶标
。
[0004]细胞外囊泡是由许多细胞类型产生的纳米级脂质囊泡，主要由微泡
(microvesicles
，
MVs)
和外泌体
(exosomes)
组成，特异性富含
miRNAs、
蛋白
、
脂类等活性分子群，在细胞间通信中起着重要的自分泌
/
旁分泌作用
。
由于
EVs
具有低毒
、
低免疫原性
、
高生物相容性等优点，
EVs
不仅可以作为药物载体递送小分子和核酸，还可以作为“无细胞治疗”药物广泛应用于肿瘤
、
衰老等疾病的治疗
。
但天然
EVs
易困于非特异性组织中
(
尤其是肝和肺
)
，导致体内靶向性不足
。
[0005]目前用于产生表达靶向配体的
EVs
融合伙伴包括
Lamp2
，
PDGFR
和
GPI
锚定信号，但它们的应用也有限制，会导致肽配体裂解或完全阻止融合蛋白表达，并且使用
GPI
锚无法提供足够的配体密度来实现
EVs
的摄取
。
将
scFv
与
Lamp2b
偶联以改造
EVs
，改造后的
EVs
并没有表现出靶向性，没有更多的表现出胞外的靶向
。
而
Longatti A
等利用融合乳粘蛋白的
C1C2
结构域以产生表达
scFv
的靶向
EVs
，但这种改造会影响细胞对
EVs
的摄取与吸收，无法特异性靶向衰老细胞和组织，不能改善衰老细胞与组织的活性，为此我们提出一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法及其应用
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法及其应用，以解决上述
技术介绍
中提出的影响细胞对
EVs
的摄取与吸收，无法特异性靶向衰老细
胞和组织，不能改善衰老细胞与组织的活性的问题
。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法，包括靶向
CD38
的嵌合抗原受体干细胞，所述靶向
CD38
的嵌合抗原受体干细胞还包括：靶向
CD38
的嵌合抗原受体
CAR
‑
CD38
，所述
CAR
‑
CD38
包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向
CD38
的单链抗体
、
胞外铰链区
、
跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向
CD38
的单链抗体包括如
SEQ ID NO
：1所示的氨基酸序列，所述靶向
CD38
的单链抗体为人源化单链抗体；
[0008]其具体步骤如下：
[0009]S1
，获得
CD38
抗原受体
scFv
片段；
[0010]所述靶向
CD38
的单链抗体
(scFv)
的重链氨基酸序列如
SEQ NO.1
所示，轻链序列如
SEQ NO.2
所示；所述靶向
CD38
的单链抗体
(scFv)
的编码基因包括
SEQ ID NO
：3所示的核苷酸序列；
[0011]S2
，将
CD38 scFv
序列与
CD8
铰链区和跨膜区插入
GV401
载体，获得
GV401
‑
CD38
靶向性载体；所述
CD8
铰链区和跨膜区的编码基因包括
SEQ ID NO
：4所示的核苷酸序列；
[0012]S3
，使用
293T
细胞对
GV401
‑
CD38
靶向性载体进行慢病毒的包装，获得
GV401
‑
CD38
慢病毒载体，然后感染干细胞后筛选获得
CD38
嵌合抗原受体改造的细胞
(ARM
‑
MSCs)
；
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：包括靶向
CD38
的嵌合抗原受体干细胞，所述靶向
CD38
的嵌合抗原受体干细胞还包括：靶向
CD38
的嵌合抗原受体
CAR
‑
CD38
，所述
CAR
‑
CD38
包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向
CD38
的单链抗体
、
胞外铰链区和跨膜区的氨基酸序列，所述靶向
CD38
的单链抗体为人源化单链抗体；其具体步骤如下：
S1
，获得
CD38
抗原受体
scFv
片段；
S2
，将
CD38 scFv
序列与
CD8
铰链区和跨膜区插入
GV401
载体，获得
GV401
‑
CD38
靶向性载体；
S3
，使用
293T
细胞对
GV401
‑
CD38
靶向性载体进行慢病毒的包装，获得
GV401
‑
CD38
慢病毒载体，然后感染干细胞后筛选获得
CD38
嵌合抗原受体改造的细胞
(ARM
‑
MSCs)
；
S4
，分离得到靶向性细胞外囊泡
ARM
‑
EVs。2.
根据权利要求1所述的一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：所述靶向
CD38
的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连
。3.
根据权利要求2所述的一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：所述胞外铰链区用于促进所述靶向
CD38
的单链抗体与衰老组织上的
CD38
结合，所述胞外铰链区包括
CD8
α
铰链区
、CD28
铰链区
、CD4
铰链区
、CD5
铰链区
、CD134
铰链区
、CD137
铰链区
、ICOS
铰链区中的一种或多种的组合
。4.
根据权利要求2所述的一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：所述跨膜区用于固定所述靶向
CD38
的嵌合抗原受体
CAR
‑
CD38
，所述跨膜区包括
CD3
跨膜区
、CD4
跨膜区
、CD8
跨膜区
、CD28
跨膜区中的一种或多种的组合
。5.
根据权利要求1所述的一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：所述
S1
中靶向
CD38
的
scFv
片段的获得，选取亲和力最高的序列
028。6.
根据权利要求1所述的一种靶向
CD38
的干细胞来源细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：所述
S3
中慢病毒包装具体步骤为；步骤一，质粒转染前
24h
，用胰蛋白酶消化对数生长期的
293T
细胞，以含
10
％血清的培养基调整细胞密度约5×
106细胞
/15ml
，重新接种于
10cm
细胞培养皿，
37℃、5
％
CO...

【专利技术属性】
技术研发人员：隆耀莹，杨汴蕾，李秋柏，陈智超，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：