一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用，所述溶瘤病毒基因组中包含抗人CTLA4抗体和人IL‑21的基因编码序列，并能表达抗人CTLA4抗体和人IL‑21，将免疫治疗的抑瘤效果与病毒治疗的溶瘤效应有效结合起来，制备了一种可高效表达αCTLA4‑Fc(ALIE)‑IL21基因溶瘤病毒，在溶瘤病毒发挥溶瘤效应裂解肿瘤细胞的同时，通过大量表达αCTLA4‑Fc(ALIE)杀伤肿瘤微环境的调节性T细胞（Regulatory T Cells,Treg），或阻断其抑制效应，从而上调肿瘤微环境的免疫应答，提升抗肿瘤效应；同时，该溶瘤病毒大量表达IL21，进一步激活肿瘤微环境中T细胞与NK细胞的杀伤功能，发挥多重的抗肿瘤效果。相对于单纯的基因疗法或者病毒疗法增强了其对恶性肿瘤的杀伤能力。

A Novel Oncolytic Virus and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用
本专利技术属生物医学
，具体涉及包含经修饰或经改造的高杀伤性抗人CTLA4抗体以及人IL-21基因的新型溶瘤病毒和所述溶瘤病毒的制备方法以及在抗肿瘤方面的应用。
技术介绍
由于标准肿瘤治疗方案在晚期肿瘤治疗中的有限的治疗效果以及严重副作用，靶向肿瘤的溶瘤病毒在近几十年里引起了极大的关注。溶瘤病毒得益于其自身可选择性的在肿瘤局部感染并裂解肿瘤细胞的特性，正在越来越多的成为抗肿瘤的首选。溶瘤病毒的肿瘤选择性可以是本身的肿瘤趋向性，也可以是基因修饰的结果。溶瘤病毒可作用于多个细胞通路，以此减少肿瘤的抗性，还可以诱导不同形式的细胞死亡。另外，溶瘤病毒可以打破肿瘤微环境的免疫耐受，诱导长期的肿瘤特异性免疫应答。溶瘤病毒可特异性的转运治疗性蛋白进入肿瘤组织，伴随病毒的进一步复制增加在恶性肿瘤细胞中表达水平。另外，溶瘤病毒可以同化疗与放疗联合使用。近几十年来，溶瘤病毒治疗以其突出的效果引起了广泛关注，对其的相关研究也取得了长足的进展。目前腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒-1(herpessimplexvirus-1，HSV-1)、新城疫病毒等已经相继被改造成溶瘤病毒。2006年，溶瘤腺病毒产品(oncorine)在中国已经用于临床治疗，主要用于治疗鼻咽癌等。该溶瘤病毒是将人5型腺病毒E1B-55kD区删除，使该病毒可在p53基因突变的癌细胞中繁殖并杀伤宿主细胞，产生溶瘤治疗作用。但是，临床数据显示这种基于p53基因突变的溶瘤腺病毒的治疗效果并不十分理想。Jennerex的JX-594是美国生物治疗公司的一种经过修改的牛痘病毒。在2013年完成的二期临床试验中，发现原发性肝癌患者在注射了高剂量的病毒后，其生命延长时间的中间值可达到14.1个月，而接受低剂量注射的患者只有6.7个月的生命延长期。BioVex生物技术公司研发的基因工程化的单纯疱疹病毒OncoVEXGM-CSF已于2015年10月通过了FDA的批准，成为世界首个上市的溶瘤病毒产品。OncoVex在选择性地杀灭肿瘤细胞同时，表达分泌GM-CSF，启动机体产生系统的免疫应答，杀伤剩余局部肿瘤细胞及其转移的肿瘤细胞。2009年BioVex公布的一项转移性黑色素瘤II期试验的结果显示，50名患者中有26％对治疗有反应，更有8名患者完全恢复健康。2013年3月，安进(Amgen)公布了OncoVex的治疗数据，临床证明它能成功地让晚期患者的肿瘤缩小，在超过400名试验患者的III期研究中，OncoVex要比同类其他药物更加有效。溶瘤病毒的确正在成为治疗肿瘤的利器，但溶瘤病毒依然需要进一步地开发和改进，来增强局部及全身性抗肿瘤作用，并减少毒副作用。为了增强溶瘤病毒的抗肿瘤效应，国际上采用的主要策略之一是“基因-病毒治疗”，即将外源性治疗基因导入溶瘤病毒，包括诱导细胞凋亡基因、靶向肿瘤微环境的基因和免疫调节基因等。这种策略不仅在病毒治疗研究领域开辟了新途径，也为癌症的基因治疗提供了新的载体，已经被广泛应用于肿瘤生物治疗研究。在靶向肿瘤微环境的免疫治疗策略中，调节性T细胞(RegulatoryTCells,Treg)近期成为领域关注的热点之一。研究发现，Treg不仅抑制异常针对自身抗原的免疫应答，而且抑制抗肿瘤免疫应答，大量Treg细胞浸润进入肿瘤组织与不良的预后相关，移除Treg细胞能够唤起并强化抗肿瘤免疫应答。但是，系统性的删除Treg细胞可能造成有毒性的自身免疫应答。因此，有必要设计一种新型靶向肿瘤微环境中Treg的免疫治疗策略，以唤起有效性的抗肿瘤免疫应答而同时不会造成自身免疫反应。相比于经典的Treg细胞（FOXPro3+T细胞），效应Treg（CD4+CD25+T）是肿瘤微环境中的主要的抑制型Treg亚群，可特异性的作用于抗肿瘤的效应性T细胞，其表面高表达细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxicT-lymphocyte-associatedprotein4,CTLA-4)分子。针对CTLA4的抗体可介导杀伤效应Treg细胞从而削弱其抑制活性。因此，在溶瘤病毒中搭载CTLA4的抗体以特异性清除Treg细胞，将显著提升肿瘤免疫治疗效果。在抗肿瘤的免疫治疗策略研究中，除了拮抗负向调控作用以外，还可以通过强化正向的抗肿瘤免疫应答以提高肿瘤杀伤效果。介素21(Interleukin-21,IL-21)是一种多效性免疫调节细胞因子，由T辅助细胞（Tfollicularhelpercells,Tfh）、TH17细胞和NKT细胞分泌。IL-21可诱导CD8+T细胞分泌INF-γ与细胞毒作用进而增强杀伤性活性，同时，IL-21参与调控NK细胞的发育和增值过程进而提升NK细胞的ADCC活性。在溶瘤病毒中搭载IL-21基因也有望增强其抗肿瘤作用。本专利技术以溶瘤病毒痘苗病毒天坛株为研究模式，发现痘苗病毒天坛株自身具有强大的抗肿瘤作用，搭载靶向肿瘤微环境的基因和免疫调节基因可显著增强抗肿瘤效果。本专利技术将着重阐述痘苗病毒天坛株及其搭载靶向肿瘤微环境的基因和免疫调节基因的溶瘤功能。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是：急需一种新型溶瘤病毒，该溶瘤病毒能够在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，同时它还搭载靶向肿瘤微环境的基因抗人CTLA4的高杀伤性抗体，协助清除肿瘤微环境中的调节T细胞，以及人的免疫调节基因IL-21来增强抗肿瘤效果。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种新型溶瘤病毒，所述溶瘤病毒基因组中包含抗人CTLA4抗体和人IL-21的基因编码序列，并能表达抗人CTLA4抗体和人IL-21。优选的，所述溶瘤病毒基因组中所包含的抗人CTLA4抗体基因和人的IL-21基因为αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21，其核苷酸编码序列如SEQIDNO：3所示，表达的αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：4所示的。优选的，所述溶瘤病毒为包含SEQIDNO:3所示αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21目的基因的重组痘苗病毒天坛株，命名为痘苗病毒天坛株rTV-αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21，其保藏编号为：CCTCCNO:V201934，保藏日期为2019年5月21日，保藏地址为中国典型培养物保藏中心。优选的，所述抗人CTLA4抗体为αCTLA4-Fc(ALIE)，即：抗人CTLA抗体中Fc突变体具有A330L/I332E突变（ALIE抗体）。优选的，所述αCTLA4-Fc(ALIE)和IL-21的核苷酸序列之间可采用T2A剪切肽、P2A或者IRES相连接，两段核酸序列可在一个载体同时表达，且两段核酸序列中αCTLA4-Fc(ALIE)可位于序列的5’端或者3’端；或αCTLA4-Fc(ALIE)与IL-21两段核酸序列表达在不同的载体上但联合使用。优选的，所述溶瘤病毒经过修饰以编码和表达αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21基因，其功能片段或变体，所述基因或其功能片段或变体与SEQIDNO:3、SEQIDNO:4具有至少90％序列同一性。优选的，其病毒骨架来源于经修饰或经改造的痘苗病毒天坛株、纽约株、哥本哈根株、金丝雀株、安卡拉株，腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、水痘－带本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒基因组中包含抗人CTLA4抗体和人IL‑21的基因编码序列，并能表达抗人CTLA4抗体和人IL‑21。

【技术特征摘要】
1.一种新型溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒基因组中包含抗人CTLA4抗体和人IL-21的基因编码序列，并能表达抗人CTLA4抗体和人IL-21。2.根据权利要求1所述一种新型溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒基因组中所包含的抗人CTLA4抗体基因和人的IL-21基因为αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21，其核苷酸编码序列如SEQIDNO：3所示，表达的αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：4所示的。3.根据权利要求1所述一种新型溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒为包含SEQIDNO:3所示αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21目的基因的重组痘苗病毒天坛株，命名为痘苗病毒天坛株rTV-αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21，其保藏编号为：CCTCCNO:V201934，保藏日期为2019年5月21日，保藏地址为中国典型培养物保藏中心。4.根据权利要求1所述一种新型溶瘤病毒，其特征在于，所述抗人CTLA4抗体为αCTLA4-Fc(ALIE)，即：抗人CTLA抗体中Fc突变体具有A330L/I332E突变（ALIE抗体）。5.根据权利要求3所述一种新型溶瘤病毒，其特征在于，所述αCTLA4-Fc(ALIE)和IL-21的核苷酸序列之间可采用T2A剪切肽、P2A或者IRES相连接，两段核酸序列可在一个载体同时表达，且两段核酸序列中αCTLA4-Fc(ALIE)可位于序列的5’端或者3’端；或αCTLA4-Fc(ALIE)与IL-21两段核酸序列表达在不同的载体上但联合使用。6.根据权利要求2所述一种新型溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒经过修饰以编码和表达αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21基因，其功能片段或变体，所述基因或其功能片段或变体与SEQIDNO:3、SEQIDNO:4具有至少90％序列同一性。7.根据权利要求1所述一种新型溶瘤病毒，其特征在于，其病毒骨架来源于经修饰或经改造的痘苗病毒天坛株、纽约株、哥本哈根株、金丝雀株、安卡拉株，腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、水痘－带状疱疹病毒（varicella-zostervirus，VZV）载体、呼吸道合胞病毒（RespiratorySyncytialVirus,RSV）、生里基森林病毒(Semlikiforestvirus，SFV)，EB病毒、巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、天花病毒、痘苗病毒、传染性软疣病毒、羊口疮病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒、肠道病毒、塞内卡病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、口蹄疫病毒、披膜病毒、甲病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、辛德毕斯病毒、风疹病毒、冠状病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建青，张晓燕，丁相卿，陈晔，陈添悦，廖启彬，
申请(专利权)人：上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：上海,31