本发明专利技术公开了一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用。该重组火鸡疱疹病毒为在火鸡疱疹病毒(HVT)的编码序列的非必需复制区中的HVT‑065和HVT‑066基因之间插入外源基因表达盒；其中，外源基因表达盒由MCMV启动子、外源基因和SV40 poly A依次连接而成；所述的外源基因为H7HA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还提供该重组火鸡疱疹病毒的构建方法，是利用超声裂解破碎的方法进行纯化，缩短筛选的时间，获得的重组火鸡疱疹病毒rHVT‑H7HA对高致病性H7N9亚型禽流感病毒提供良好的保护，可用于后续开发新型的禽流感病毒疫苗。
Construction and Application of Recombinant Turkey Herpesvirus Expressing HA Protein of H7N9 Subtype Highly Pathogenic Avian Influenza Virus
【技术实现步骤摘要】
表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用
本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，特别涉及一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用。
技术介绍
火鸡疱疹病毒(HVT)Fc-126株与马立克氏病病毒(MDV)具有抗原相关性，被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗，该疫苗无致致病性，保护效果出色[1]。相比其它病毒载体，HVT具有其独特的优势[2-7]，如：HVT本身就是疫苗候选株，可以感染的宿主包括鸡和水禽，但不致病，庞大的基因组可为外源基因提供多个插入位点，具有成为多价疫苗的潜力；HVT为细胞结合性病毒，可克服母源抗体的影响，可同时诱导较强的细胞和体液免疫；HVT可在宿主体内终生繁殖，一次免疫可以使宿主持续免疫；HVT载体疫苗适合早期规模化免疫，节约成本，提高效率。目前多家公司研制的的表达不同抗原的基于HVT载体的商品化疫苗已经上市[8-10]，例如：-ND-SB(MSDAnimalHealth)、HVT-ILT(MSDAnimalHealth)、HVT-IBD(Merial)、HVT-AI(Ceva)、HVT-NDV(Ceva)、HVT-IBD(Ceva)。HVT载体的商品化疫苗在多个国家的家禽养殖业中投入使用，保护效果良好。哈尔滨兽医研究所开展了H5N1亚型禽流感病毒HVT载体疫苗的研究[11]，扬州大学和中国农业大学开展了H9亚型禽流感病毒HVT载体疫苗的研究[12,13]。在第5波H7N9亚型禽流感病毒流行中，出现了对鸡具有高致病性H7N9亚型禽流感病毒，对养禽业造成重大经济损失[14,15]；2016年10月至2017年6月，全国有752例人感染H7N9禽流感病毒。我国从2017年下半年开始在全国养殖场推广H5/H7禽用二价苗，人感染H7N9禽流感病毒病例迅速下降，该研究结果表明，病毒主要在家禽之间以及从家禽到人类传播，疫苗可以有效阻断病毒在家禽之间传播，从而减少病毒在家禽和人之间传播[16]。因此，禽用禽流感疫苗不但可以促进养禽业发展而且可以降低H7N9流感病毒对公共卫生安全的威胁。目前国内使用的禽用禽流感疫苗为全病毒灭活疫苗。全病毒灭活疫苗虽然可以保护家禽，降低禽流感爆发的风险，但是全病毒灭活疫苗自身的缺陷增加了禽流感防控的难度[17,18]。首先，该类疫苗容易受母源抗体干扰，需要大剂量多次免疫，成本高。其次，不能准确区分野毒感染和疫苗免疫，为禽流感流行病学监控增加难度。而且，由于该类疫苗主要产生体液免疫，因此疫苗株与流行株要高度同源，否则免疫效果不理想。开发新型的禽流感病毒疫苗对防控禽流感具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒。本专利技术的另一目的在于提供一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法。本专利技术的又一目的在于提供所述表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，所述的重组火鸡疱疹病毒为在火鸡疱疹病毒(HVT)的编码序列的非必需复制区中的HVT-065和HVT-066基因之间的非编码区插入外源基因表达盒；所述的外源基因表达盒由MCMV启动子、外源基因和SV40polyA依次连接而成；所述的外源基因为H7HA基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述的MCMV启动子优选为鼠源MCMV启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。所述的SV40polyA的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。所述的火鸡疱疹病毒优选为火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株。所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的分类命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA，保藏编号为CCTCCNO:V201914，于2019年4月29日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，为利用同源重组原理，将外源基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)的基因组中，经过筛选和纯化获得重组病毒，即所述表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒。所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，具体包括如下步骤：(1)构建转移质粒pG-65/66-H7HA①以火鸡疱疹病毒的总DNA为模板，SEQIDNO:4和SEQIDNO:5为引物，进行PCR扩增，得到左同源臂L1片段；同时，以SEQIDNO:6和为SEQIDNO:7引物，进行PCR扩增，得到右同源臂R1片段；②用引物SEQIDNO:5和SEQIDNO:9融合左同源臂L1片段和SV40polyA序列，得到L2片段；用引物SEQIDNO:7和SEQIDNO:10融合右同源臂R1片段和MCMV启动子序列，得到R2片段；③将L2片段和R2片段用限制性内切酶Aflii进行酶切，然后用T4连接酶连接L2酶切后的产物和R2酶切后的产物，得到L2+R2片段；最后将L2+R2片段克隆到pGEM-T-Vector上，得到重组质粒pG-65/66；④利用限制性内切酶Aflii和NheI，以及T4连接酶将H7HA片段亚克隆到重组质粒pG-65/66中，得到转移质粒pG-65/66-H7HA；其中，H7HA片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；(2)构建和纯化重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA⑤将火鸡疱疹病毒接种原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，得到感染亲本病毒的细胞；接着将转移质粒pG-65/66-H7HA线性化后电转染感染亲本病毒的细胞，然后在37℃条件下培养至细胞病变，经过鉴定、筛选和富集，得到感染重组病毒的细胞；⑥将感染重组病毒的细胞重悬在SPGA缓冲液中，然后进行超声破碎提取游离的病毒粒子，筛选能够表达H7亚型禽流感病毒HA蛋白的重组病毒火鸡疱疹rHVT-H7HA，即为所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒。步骤①中所述的火鸡疱疹病毒优选为火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株。步骤②中所述的SV40polyA的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。步骤②中所述的MCMV启动子优选为鼠源MCMV启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。步骤⑤中所述的线性化为采用限制性内切酶BsmBI进行线性化。步骤⑤中所述的电转染的条件为：1.5kV/cm，脉冲时间0.5ms。步骤⑤中所述的培养所用的培养基为含有2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基。步骤⑤中所述的筛选为采用有限稀释法进行筛选。步骤⑥中所述的SPGA缓冲液配方如下：蔗糖0.218M，磷酸二氢钾0.0038M，磷酸氢二钾0.0072M，谷氨酸钠0.0049M，牛血清白蛋白1％(w/w)。步骤⑥中所述的超声破碎提取体系中感染重组病毒的细胞的浓度优选为2×106个/mL。步骤⑥中所述的超声破碎的条件优选为：功率140W～220W，时间2min。所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒在重组表达HA蛋白中的应用。所述的表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述的重组火鸡疱疹病毒为在火鸡疱疹病毒的编码序列的非必需复制区中的HVT‑065和HVT‑066基因之间的非编码区插入外源基因表达盒；所述的外源基因表达盒由MCMV启动子、外源基因和SV40 poly A依次连接而成；所述的外源基因为H7HA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述的重组火鸡疱疹病毒为在火鸡疱疹病毒的编码序列的非必需复制区中的HVT-065和HVT-066基因之间的非编码区插入外源基因表达盒；所述的外源基因表达盒由MCMV启动子、外源基因和SV40polyA依次连接而成；所述的外源基因为H7HA基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述的MCMV启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述的SV40polyA的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述的火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒FC126株。3.根据权利要求1所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述的重组火鸡疱疹病毒的分类命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA，保藏编号为CCTCCNO:V201914，于2019年4月29日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心。4.一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)构建转移质粒pG-65/66-H7HA①以火鸡疱疹病毒的总DNA为模板，SEQIDNO:4和SEQIDNO:5为引物，进行PCR扩增，得到左同源臂L1片段；同时，以SEQIDNO:6和为SEQIDNO:7引物，进行PCR扩增，得到右同源臂R1片段；②用引物SEQIDNO:5和SEQIDNO:9融合左同源臂L1片段和SV40polyA序列，得到L2片段；用引物SEQIDNO:7和SEQIDNO:10融合右同源臂R1片段和MCMV启动子序列，得到R2片段；③将L2片段和R2片段用限制性内切酶Aflii进行酶切，然后用T4连接酶连接L2酶切后的产物和R2酶切后的产物，得到L2+R2片段；最后将L2+R2片段克隆到pGEM-T-Vector上，得到重组质粒pG-65/66；④利用限制性内切酶Aflii和NheI，以及T4连接酶将H7HA片段亚克隆到...
【专利技术属性】
技术研发人员：亓文宝，苏冠铭，廖明，张旭，陈意群，马凯雄，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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