人源抗H5N1血凝素蛋白广谱中和性抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人源抗Ｈ５Ｎ１血凝素蛋白广谱中和性抗体，该抗体是运用噬菌体表面呈现技术筛选获得，决定抗体特异性的高变区（ＣＤＲｓ）序列如图１所示。本发明专利技术抗体特异性识别Ｈ５Ｎ１高致病性禽流感病毒颗粒抗原，且均针对禽流感病毒血凝素蛋白ＨＡ，与禽流感病毒Ｈ５Ｎ１具有明显的免疫荧光反应和酶联免疫反应，具有抗禽流感病毒Ｈ５Ｎ１感染的中和活性功能。可将本发明专利技术抗体制成临床上用于预防和治疗由Ｈ５Ｎ１禽流感病毒引起的人禽流感的特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由禽流感病毒Ｈ５Ｎ１引起的人感染禽流感。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程抗体技术，具体涉及一种人源抗H5N1血凝素蛋白广谱中和 性抗体，本专利技术还涉及该抗体在制备预防或治疗禽流感药物中的应用。
技术介绍
高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza, HPAI)是由正黏病毒科流感 病毒属A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。高致病性禽流感病毒H5N1自1997年发 生18人感染6人死亡疫情以来， 一直受到国际社会的高度关注，特别是自2003年以来 高致病禽流感病毒H5N1动物疫情在亚洲已成地方性流行，并且已经蔓延到欧洲和非 洲，人感染病例以及发生人感染病例的国家和地区不断扩大。高致病性禽流感病毒H5N1 突破了种属屏障不仅对禽类带来巨大威胁，严重影响国家的经济发展，而且对人类健康 也带来巨大的威胁，会不会由H5N1禽流感病毒导致一次流感大流行已引起全球的高度 关注。流感病毒是一种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒，基因组分为8个节 段。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的 主要免疫原性抗原。HA识别靶细胞表面受体并与受体相结合，具有与宿主细胞膜融合 活性，能够诱导机体产生保护性中和抗体。由于HA基因突变而引起的HA抗原变异 往往会导致免疫失败和变异毒株流行，流感病毒频繁并且持续的发生抗原性变异，目前 缺乏有效的人用禽流感疫苗及治疗药物。作为一类新型特异性抗病毒感染的生物工程制 剂，中和性抗体在抗感染治疗及紧急被动免疫预防方面一直扮演着重要的角色。因此， 研制特异性针对H5N1禽流感病毒的中和性抗体尤其是针对不同H5N1分离株具有广谱 中和效应的抗体以用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的。含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠 久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验证 明，如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、麻瘆病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗 体可以在体内00%保护动物免受病毒攻击。已有研究表明通过局部注射人免疫球蛋白， Fab或F(ab，)2等形式单抗进行被动免疫获得较好的预防与治疗甲型人流感的效果 (Ramisse F, et al. Clin Exp Immunol. 1998, 111(3):583-587; Okuno Y, et al. J Virol. 1994, 68 (1): 517-520; Mozdzanowska K, et al. J Virol. 2003, 77 (15): 8322-8328.);关于H5亚型的 抗体应用研究表明，抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白中和性抗体对小鼠有良好保护和 治疗效果(Simmons P C, et al. Plos Med. 2007, 4(5): 0928-0936; Hanson B J, et al. Respir Res. 2006, 7: 126-127.);在1918西班牙流感治疗中，已有用病人恢复期血清治疗获得良 好效果的报道(Luke TC, et al. Ann Intern Med. 2006, 145: 599—609)，介于血制品容易污 染，且来源非常有限，使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷，而人源基因工程抗体研究的不断深入，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术 研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础 研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗 体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望，在抗病毒感 染生物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药，即所谓的抗体药(Antibody Drug )。以抗原免疫动物获得多抗血清的途径一直是获得抗体的经典方法，但缺乏特异性 和均一性。继而建立的B淋巴细胞杂交瘤技术使得众多科学家通过细胞工程可以在体 外定向地制备各种单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb ),其特异性强，性质均一 ， 易于大量生产。然而McAb多为鼠源性，鼠源McAb的异源性反应极大地限制了 McAb作为治疗制剂在人体的应用。免疫球蛋白(Vaccinia immune globulin, VIG )作为 抗体成分主要来自捐献者(恢复期病人)免疫血清，从获得阳性血清到通过安全性检测 均需花费大量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于来源于血清所以容 易发生血源性传播疾病的感染。如同当初血源性疫苗向基因工程疫苗的转变，现在也急需用基因工程抗体替代血 源性VIG,如通过嵌合抗体技术(Boulianne,G丄.et al.,1984; Morrison,S丄.et al.,1984 )、 人源化抗体技术(Jones,P.T. et al.,1986)、携带人单抗的转基因小鼠技术(Green,L丄.et al.,1994)、异体杂交瘤技术(James,K.et al.，1987)、噬菌体表面展示技术(Barbas，C.F. et al.,1991)等产生人源化抗体，现已成为国内外研究的重大方向，并正在逐步走向成功， 所有一切都为本专利技术解决问题提供了新思路。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种人源抗H5N1血凝素蛋白广谱中和性抗体及其 活性片段。本专利技术的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的基因。 本专利技术的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备预防或治疗禽流感药物或诊断试剂中的应用。本专利技术运用噬菌体表面呈现技术，从中国安徽某禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞，通过基因工程手段构建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异抗禽流感病毒基因工程抗体Fab段。获得的Fab段抗体分别命名为AVFluFabll和AVFluFab33。这两株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性 基因序列决定的，并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合高致病性禽流感病毒 H5N1的功能性抗体。它们特异性识别H5N1高致病性禽流感病毒颗粒抗原，且均针对禽流感病毒血凝素蛋白HA,与禽流感病毒H5N1具有明显的免疫荧光反应(IFA)和 酶联免疫(ELISA)反应，具有抗禽流感病毒H5N1感染的中和活性功能。AVFluFabll和AVFluFab33特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗高致 病性禽流感病毒H5N1抗体基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于中国安徽 H5N1禽流感恢复期病人血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序 列组合及其CDR区之间框架区序列组成了每个抗体可变区序列特征，AVFluFabll和 AVFluFab33分别隶属于抗体重链家族VH4和VH3,抗体轻链家族VL2和VL1。抗体 蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3 中特异性核苷酸序列及其互补所本文档来自技高网...

【技术保护点】
人源抗Ｈ５Ｎ１血凝素蛋白抗体，其轻链ＣＤＲ１、ＣＤＲ２和ＣＤＲ３的氨基酸序列分别为ＴＧＴＳＳＤＶＧＤＹＮＹＶＳ、ＤＶＮＫＲＰＳ和ＳＳＹＴＳＳＮＴＷＶＦ，其重链ＣＤＲ１、ＣＤＲ２和ＣＤＲ３的氨基酸序列分别为ＳＹＹＷＳ、ＹＬＦＤＳＧＳＴＫＹＮＰＳＬＴＳ和ＧＦＷＧＬＤＧＦＤＩ；或者其轻链ＣＤＲ１、ＣＤＲ２和ＣＤＲ３的氨基酸序列分别为ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ、ＧＮＳＮＲＰＳ和ＱＳＹＤＳＳＶＶＶＦ，其重链ＣＤＲ１、ＣＤＲ２和ＣＤＲ３的氨基酸序列分别为ＮＹＹＡＭＳ、ＡＩＳＧＮＧＧＳＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＤＤＳＹＤＧＧＧＨＹＧＬＨＮＷＦＤＳ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁米芳，孙丽娜，李德新，舒跃龙，刘琴芝，李川，张全福，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]