一种表达HA基因的重组火鸡疱疹病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种表达禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒及其应用，是以病毒载体HVT‑BAC为平台，联合使用RED/ET重组技术和ccdB反向筛选技术通过两步重组法制备而来，其中，HA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。其有益效果在于，本发明专利技术所使用的HA基因来自我国近年来广泛流行的H9N2毒株，对禽类具有广泛的免疫原性，本发明专利技术的制备方法实现了外源基因的快速、准确重组，所使用的筛选标记有利于减化筛选步骤，得到的重组病毒株能稳定传代，用该重组病毒株制备的疫苗可以刺激鸡体产生潜伏感染，引起终生免疫，为有效防控H9N2禽流感和马立克氏病提供技术支持，具有重要的生产指导意义。

A Recombinant Turkey Herpesvirus Expressing HA Gene and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种表达HA基因的重组火鸡疱疹病毒及其应用
本专利技术属于动物基因工程疫苗
，更具体地，涉及一种表达HA基因的重组火鸡疱疹病毒及其应用。
技术介绍
目前养禽生产中广泛使用的H9N2亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)全病毒灭活疫苗虽具有良好的免疫效果，但此类疫苗不能诱导有效的细胞免疫应答和黏膜免疫应答，同时受母源抗体的干扰较大。AIV易发生抗原漂移，并且一般造成病毒的中小型流行，然而抗原变异则极易造成世界性大流行。因此禽流感的防控难点之一就在于AIV的抗原变异。目前常用的诊断方法有病毒分离，血凝试验和血凝抑制试验，病毒中和试验，荧光免疫技术，琼脂扩散试验，酶联免疫吸附试验，补体结合实验等等。HA基因的变异性很强，最能反应出AIV的变异程度。因此在生产中及时准确的掌握HA基因关键位点的变异，会对监控AIV的流行情况，选用合适的疫苗进行免疫有指导作用。基于HA基因的活载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗均可对同一HA亚型病毒的攻击产生近100％的保护，但由于HA变异率极高，使得基于该基因的多种疫苗的保护性是具有亚型特异性的，即仅仅局限在与所表达的HA为同一亚型之间的作用，而对其它亚型病毒攻击的保护性较差。目前，H9N2亚型AIV灭活苗的使用对于该病的防控与流行起到了重要作用，但是灭活苗不能针对同一亚型的变异株或者不同亚型的变异株产生交叉保护，此类疫苗不能有效诱导细胞免疫和黏膜免疫应答，使用过程中受母源抗体的干扰较大。因此亟须新型疫苗的开发。
技术实现思路
本专利技术针对于以上问题，提供一种以HVT病毒为载体，表达H9N2病毒HA抗原基因的病毒株rHVT，所述HA基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还保护上述表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒株rHVT的制备方法，所述方法包括以下步骤：S1：构建火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC将火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126的基因组DNA通过同源重组的方法插入到BAC载体上得到火鸡疱疹病毒载体pHVT-BAC，其中火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126株全基因组序列参见GenBank登录号No.AF291866；S2：HA基因表达盒的扩增以H9N2亚型禽流感病毒基因组的cDNA为模板，扩增得到5’端带有同源臂及启动子，3’端带有同源臂及poly(A)尾的HA基因表达盒，其中，同源臂为与HVT-FC126插入位点两端序列同源；S3：ccdB-amp选择标记基因表达盒的扩增以质粒p15A-ccdB-amp为模板，扩增得到两侧带有同源臂的选择标记基因ccdB-amp基因表达盒；S4：构建含有HA基因的重组质粒pHVT-BAC-HA先利用RED/ET重组将选择标记基因ccdB-amp表达盒替换HVTUS2区，再利用RED/ET重组将HA基因表达盒替换ccdB-amp表达盒，从而得到含有H9N2禽流感HA基因的重组质粒pHVT-BAC-HA；S5：制备表达H9N2禽流感HA基因的火鸡疱疹病毒毒株将重组质粒pHVT-BAC-HA转染CEF细胞拯救出重组病毒，即获得表达H9N2禽流感HA基因的火鸡疱疹病毒rHVT-HA。进一步，所述表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒株rHVT的制备方法包括以下步骤：SS1：含有同源臂的BAC骨架载体的构建；以提取的HVT感染CEF细胞后的总DNA为PCR模板，分别扩增包含火鸡疱疹病毒US2区上、下游同源臂的基因片段，引物如下：同源臂A上游引物为：FA：5’-AAAATCGATGTAAAGGTTGG-3’；同源臂A下游引物为：RA：5’-AGTTCTGCAGTACCGGATTTG-3’；同源臂B上游引物为：FB：5’-GTGTCACGAACTTTACCGAA-3’；同源臂B下游引物为：RB：5’-GCTTTGTATCTCCAAGAACAC-3’；将扩增产物同源臂A和同源臂B回收、纯化并连接质粒pGEM，得到含有同源臂A和B的质粒pGAB-T；以质粒pGE-gpt为PCR模板，扩增加压筛选标记基因gpt表达盒，所用引物如下：gpt基因上游引物Fgpt：5’-ATGTTAATTAAGAAGCTAGGCGCGCCTGT-3’；gpt基因上游引物Rgpt：5’-ATGTTAATTAAGGGCCGGCC-3’；再将gpt表达盒与pGAB-T酶切、连接、转化得到含有同源臂A和B以及筛选标记基因gpt的载体pGAB-gpt；提取质粒pBeloBAC11，经HindIII酶切，回收获得BAC载体片段，将BAC载体片段与载体pGAB-gpt酶切连接、转化，获得重组转移载体pGAB-gpt-BAC11；取新鲜制备的CEF细胞，接种HVT-FC126病毒，转染重组转移载体pGAB-gpt-BAC11；经筛选、纯化得到重组病毒rHVT-BAC；将上述重组病毒rHVT-BAC感染CEF细胞的总DNA电转到大肠杆菌DH10B感受态细胞，鉴定筛选得到含有HVT全基因组的病毒载体pHVT-BAC；SS2：含有HA基因的真核表达质粒的构建和HA基因表达盒的扩增；扩增获得SEQIDNo.1所示HA基因，将扩增产物HA基因和质粒pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞，筛选得到真核表达质粒pcDNA-HA；HA基因表达盒的构建；以pcDNA-HA质粒为模板，扩增得到5’端带有50bp同源臂及CMV启动子和3’端带有50bp同源臂及poly(A)尾的HA基因表达盒，扩增引物如下：F1：5’-TTCGCTCGCGCGACTCCATACATTGAATAATTCCACACGTCAGCTCATCTGTTGACATTGATTATTGACT-3’；R1：5’-ATGAATGGCAGAAATTCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTGGTCGAAAGCCATAGAGCCCACCGCATC-3’SS3：ccdB-amp基因表达盒的扩增；以p15A-ccdB-amp为模板，扩增两侧带有50bp同源臂的选择标记基因ccdB-amp基因表达盒，所用引物如下：F2：5’-TTTGTTTATTTTTCTAAATAC-3’；R2：5’-AGCCCCATACGATATAAGTTGT-3’；SS4：构建含有HA基因的重组质粒pHVT-BAC-HA利用RED/ET重组将选择标记基因ccdB-amp表达盒替换HVTUS2区：将psc101-ccdA-gbaA质粒，电转到含pHVT-BAC的DH10B的感受态细胞中，得到包含pHVT-BAC和psc101-ccdA-gbaA质粒的DH10B的感受态细胞；将扩增回收的ccdB-amp基因表达盒电转到包含pHVTBAC和psc101-ccdA-gbaA质粒的DH10B的感受态细胞中，得到重组质粒为pHVT-BAC-ccdB-amp-ccdA；利用RED/ET重组将HA基因表达盒替换在HVTUS2区；将HA基因表达盒电转进含有重组质粒pHVT-BAC-ccdB-amp-ccdA的感受态细胞中，得到重组质粒pHVT-BAC-HA；SS5：重组病毒rHVT-HA的拯救：提取重组质粒pHVT-BAC-HA，转染CEF细胞拯救出重组病毒rHVT-HA。进一步所述H9N2禽流感H本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒株rHVT‑HA，其特征在于，所述H9N2亚型禽流感病毒HA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒株rHVT-HA，其特征在于，所述H9N2亚型禽流感病毒HA基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒株rHVT-HA，其特征在于，所述rHVT-HA通过以下方法制备而来：S1：构建火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC将火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126的基因组DNA通过同源重组的方法插入到BAC载体上得到火鸡疱疹病毒载体pHVT-BAC，其中火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126株全基因组序列参见GenBank登录号No.AF291866；S2：HA基因表达盒的扩增以H9N2亚型禽流感病毒基因组的cDNA为模板，扩增得到5’端带有同源臂及启动子，3’端带有同源臂及poly(A)尾的HA基因表达盒，其中，同源臂为与HVT-FC126插入位点两端序列同源；S3：ccdB-amp选择标记基因表达盒的扩增以质粒p15A-ccdB-amp为模板，扩增得到两侧带有同源臂的选择标记基因ccdB-amp基因表达盒；S4：构建含有HA基因的重组质粒pHVT-BAC-HA先利用RED/ET重组将选择标记基因ccdB-amp表达盒替换HVTUS2区，再利用RED/ET重组将HA基因表达盒替换ccdB-amp表达盒，从而得到含有H9N2禽流感HA基因的重组质粒pHVT-BAC-HA；S5：制备表达H9N2禽流感HA基因的火鸡疱疹病毒毒株将重组质粒pHVT-BAC-HA转染CEF细胞拯救出重组病毒，即获得表达H9N2禽流感HA基因的火鸡疱疹病毒rHVT-HA。3.根据权利要求2所述表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒株rHVT-HA，其特征在于，所述制备rHVT-HA的方法包括以下步骤：SS1：含有同源臂的BAC骨架载体的构建；以提取的HVT感染CEF细胞后的总DNA为PCR模板，分别扩增包含火鸡疱疹病毒US2区上、下游同源臂的基因片段，引物如下：同源臂A上游引物为：FA：5’-AAAATCGATGTAAAGGTTGG-3’；同源臂A下游引物为：RA：5’-AGTTCTGCAGTACCGGATTTG-3’；同源臂B上游引物为：FB：5’-GTGTCACGAACTTTACCGAA-3’；同源臂B下游引物为：RB：5’-GCTTTGTATCTCCAAGAACAC-3’；将扩增产物同源臂A和同源臂B回收、纯化并连接质粒pGEM，得到含有同源臂A和B的质粒pGAB-T；以质粒pGE-gpt为PCR模板，扩增加压筛选标记基因gpt表达盒，所用引物如下：gpt基因上游引物Fgpt：5’-ATGTTAATTAAGAAGCTAGGCGCGCCTGT-3’；gpt基因上游引物Rgpt：5’-ATGTTAATTAAGGGCCGGCC-3’；再将gpt表达盒与pGAB-T酶切、连接、转化得到含有同源臂A和B以及筛选标记基因gpt的载体pGAB-gpt；提取质粒pBeloBAC11，经HindIII酶切，回收获得BAC载体片段，将BAC载体片段与载体pGAB-gpt酶切连接、转化，获得重组转移载体pGAB-gpt-BAC11；取新鲜制备的CEF细胞，接种HVT-FC126病毒，转染重组转移载体pGAB-gpt-BAC11；经筛选、纯化得到重组病毒rHVT-BAC；将上述重组病毒rHVT-BAC感染CEF细胞的总DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢青梅，封柯宇，申晓晨，蔺文成，张新珩，李鸿鑫，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44