一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及病毒领域，特别是指一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法。所述病毒毒株为gE、gI双基因缺失毒株，保藏号为CCTCC NO：V201749，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，本发明专利技术所构建的rPRV HN2012‑gE

A Bigenic Deletion Mutant Virus Strain of Porcine Pseudorabies and Its Construction Method

【技术实现步骤摘要】
一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法
本专利技术涉及病毒领域，特别是指一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies,PR)，即奥耶兹氏病(Aujeszky’sdisease)，其病原是伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)，牛、羊、猪等多种家畜及野生动物均可患该病[i]。PR的主要症状为发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎、神经及繁殖系统障碍，是一种急性热性高度接触性传染病[ii]。猪是该病的自然宿主和主要传染源，PRV可以感染不同年龄段的猪，主要引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状，衰竭死亡，死亡率高达100％。迄今尚未研发出可成功治疗PR的药物，因此在临床上只能采用给猪接种如PRVBartha-K61等弱毒疫苗，使猪群中PR得到有效控制。然而2011年底起，我国20多个省市已免疫过猪伪狂犬疫苗的猪群中开始出现了PR疫情的大流行。随后许多研究也陆续证实，临床上常免疫的Bartha-K61弱毒疫苗株对当前流行的PRV变异株已不能提供100％保护，这新一轮以PRV流行变异株引发的PR疫情使我国的养猪业面临巨大的挑战，因此一种可针对当前流行变异株的有效疫苗急待开发。本实验室于2012年从河南省南阳市某免疫过PRVBartha-K61疫苗猪场病死猪体内分离到了一株PRV野毒株，命名为PRV/HN2012株(CTCCNO.V201314)。基于gE、gB、gC基因的同源性和遗传进化分析结果显示，该毒株与国内近年分离的PRV流行变异株同源性最高，且在进化树中与国内近年来分离的PRV流行变异毒株位于一个分支，可作为疫苗开发的一个新方向。
技术实现思路
本专利技术提出一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法，解决了现有PRV流行而无高效灵敏度疫苗的问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株，所述病毒毒株为gE、gI双基因缺失毒株，保藏名称：重组猪伪狂犬病毒rPRVHN2012-gE-/gI-，保藏号为CCTCCNO：V201749，保藏日期：2017年10月31日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。所述的猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的构建方法，步骤如下：(1)以PRV/HN2012株为亲本毒株，分别扩增PRV/HN2012株的gE/gI基因两侧的序列作为重组同源臂克隆至pUC-19载体，构建转移质粒pUC-gE/gILR；(2)用绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因，标记步骤(1)构建的转移质粒pUC-gE/gILR，得标记后的转移质粒pUC-gE/gILRE；(3)设计靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA1和gRNA2的正向引物和反向引物，分别构建载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP和载体CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP，经双酶切、连接后，得到双敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP；(4)利用步骤(2)制备的转移质粒pUC-gE/gILRE和PRV/HN2012株的DNA共转染ST细胞，通过空斑纯化获得表达荧光蛋白的过渡病毒rPRVHN2012-gE-/gI--EGFP+；(5)将过渡病毒rPRVHN2012-gE-/gI--EGFP+的DNA基因组与步骤(2)的转移质粒pUC-gE/gILR以及步骤(3)的双敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP共转染至ST细胞，通过空斑纯化获得去除外源EGFP基因的重组病毒rPRVHN2012-gE-/gI-，即猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株。所述步骤(1)中同源臂克隆所用的扩增引物包括L同源臂引物对和R同源臂引物对，其中L同源臂引物对序列如SEQIDNO.1/SEQIDNO.2所示，R同源臂引物对序列如SEQIDNO.3/SEQIDNO.4所示。所述步骤(3)中靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA1的正向引物序列如SEQIDNO.5所示、反向引物序列如SEQIDNO.6所示；靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA2的正向引物序列如SEQIDNO.7所示、反向引物序列如SEQIDNO.8所示。所述步骤(5)中猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的鉴定引物对如SEQIDNO.11/SEQIDNO.12所示。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术釆用同源重组结合反向筛选及蚀斑克隆纯化的技术，成功构建了一株针对现今PRV流行变异毒株的gE、gI双基因缺失病毒，以期望将其用于防控当前PRV变异毒株的疫情中，为我国根除PRV创造条件。(2)本专利技术所构建的rPRVHN2012-gE-/gI-免疫组仔猪在试验过程中没有出现任何不良反应，中和抗体水平证实了该缺失病毒保持了良好的免疫原性，并且本专利技术所获得的rPRVHN2012-gE-/gI-双基因缺失病毒对仔猪是安全的，免疫后能有效并迅速产生PRV特异性抗体，是一株有希望应用于当前PRV流行防控工作的疫苗株。附图说明图1为转移质粒构建示意图。图2为PRVBartha-K61株基因组缺失位置示意图。图3为pG质粒基因结构图。图4为同源臂的扩增；M1.DNAMarkerDL2000+；1.左同源臂(gEL)；2.右同源臂(gER)；3.阴性对照。图5为重组质粒pMD-gEL、pMD-gER的酶切鉴定图；M1.DNAMarkerDL5000；1.pMD-gEL的HindⅢ/PstⅠ酶切；2.pMD-gER的BamHⅠ/PstⅠ酶切。图6为转移质粒的酶切鉴定图；M1.DNAMarkerDL5000；1.pUC-gE/gILR的HindⅢ/PstⅠ酶；2.pUC-gE/gILRE的PstⅠ酶切。图7为pG质粒的酶切鉴定图；M1.DNAMarkerDL5000、1.pG的PstⅠ酶切。图8为菌液PCR鉴定图；M1.DNAMarkerDL2000+、1-5.EGFP基因片段、6.阴性对照。图9为CRISPR/Cas9-Px459-gRNA1-EGFP以及CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP菌液PCR鉴定图；M1.DNAMarkerDL2000+、1-2.CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP；4-5.CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP扩增片段、3,6阴性对照。图10为CRISPR/Cas9-Px459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP菌液PCR鉴定图；M1.DNAMarkerDL2000+；1-4.CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP扩增片段、5.阴性对照M1.DNAMarkerDL2000+。图11为不同光照下观察到的蚀斑照片；A：常光下rPRVHN2012-gE-/gI--EGFP+形成的蚀斑；B：蓝光下rPRVHN2012-gE-/gI--EGFP+形成的蚀斑。图12为gE/gI缺失部分PCR鉴定结果图，其中M1.DNAMarkerDL5000；1.rPRVHN2012-gE-/g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株，其特征在于：所述病毒毒株为gE、gI双基因缺失毒株，保藏名称：重组猪伪狂犬病毒rPRV HN2012‑gE

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株，其特征在于：所述病毒毒株为gE、gI双基因缺失毒株，保藏名称：重组猪伪狂犬病毒rPRVHN2012-gE-/gI-，保藏号为CCTCCNO：V201749，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。2.权利要求1所述的猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的构建方法，其特征在于，步骤如下：（1）以PRV/HN2012株为亲本毒株，分别扩增PRV/HN2012株的gE/gI基因两侧的序列作为重组同源臂，克隆至pUC-19载体，构建转移质粒pUC-gE/gILR；（2）用绿色荧光蛋白作为标记基因，标记步骤（1）构建的转移质粒pUC-gE/gILR，得标记后的转移质粒pUC-gE/gILRE；（3）设计靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA1和gRNA2的正向引物和反向引物，分别构建载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP和载体CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP，经双酶切、连接后，得到双敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP；（4）利用步骤（2）制备的转移质粒pUC-gE/gILRE和PRV/HN2012株的DNA共转染ST细胞，通过空斑纯化获得表达荧光蛋白的过渡病毒rPRVHN2012-gE-/gI--EGFP...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红英，郑兰兰，赵宇，张宇，郑慧华，刘芳，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41