表达羊口疮病毒F1L蛋白的无筛选标记重组山羊痘病毒及其构建方法技术

本发明专利技术通过同源重组，创新性的利用蚀斑与反向蚀斑筛选技术，最终获得无筛选标记重组病毒，尤其是rGTPV‑F1L重组羊痘病毒，该方法简单有效，易于操作，提供了可用于重组病毒疫苗开发的无筛选标记基因重组病毒，为新型ORF疫苗研究提供了新思路和措施，具有广阔的应用前景。

Expression of F1L protein of sheep mouth sore virus and its construction

【技术实现步骤摘要】
表达羊口疮病毒F1L蛋白的无筛选标记重组山羊痘病毒及其构建方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体为涉及一种重组病毒，更具体涉及一种无筛选标记重组山羊痘病毒及其构建方法。
技术介绍
羊口疮(Orf)又称羊传染性脓疱(ContagiousEcthyma，CE)，是羊口疮病毒(orfvirus，ORFV)引起的一种人兽共患病，被我国列为B类动物传染病，也是20种最重要的危害山羊和绵羊的病毒性疫病之一。该病主要侵害羊的口唇部、尾根部和乳房等，常导致感染部位出现脓疱、溃烂和结节等症状。该病传播迅速，流行广泛，发病率高，不同品种、性别和年龄段的羊只均可感染，在羔羊中的发病率和死亡率最高，由于ORFV对羔羊口唇部具有良好嗜性，羔羊发病后口唇部伤口常继发感染多种病原菌，造成进食困难，免疫力下降，最终因营养不良和器官衰竭而死亡。ORFV也可感染鹿、松鼠、骆驼和羚羊等多种动物，偶尔感染人。目前，该病在我国分布广泛，常呈群发性流行，由于ORFV生命力顽强，对环境耐受性较好，在干燥痂皮中可以存活10年以上，且保持较好的感染性，因此，该病一旦流行，流行区域就很难彻底清除病原，不仅危害我国畜牧业发展，造成巨大经济损失，还直接威胁着人类的健康和公共卫生安全,因此该病的防控意义重大。ORFV属于痘病毒科副痘病毒属，是一种双链DNA病毒，全基因组大小为135～139kb，含有以甲硫氨酸为开头的300个左右开放性阅读框，ORFV基因组中含有131个基因。F1L基因位于ORFV基因组的中部，编码的蛋白参与病毒表面微管的合成，能够诱导机体产生中和抗体，且可与多数细胞表面的硫酸乙酰肝素(Heparansulfate，HS)受体结合，在病毒吸附和侵入细胞的过程中起到重要作用，已被认为是ORFV亚单位疫苗研制的主要候选抗原。目前，关于ORFV的防治尚无有效药物和疫苗产品，多数报道集中于疫病诊断、药物防控和病原学研究等，在可用于临床的安全、有效的疫苗产品方面仍未有突破性进展。近年来，重组活载体疫苗已成为研究热点，其克服了常规疫苗的缺点，兼有灭活疫苗和减毒疫苗的优点。重组活载体疫苗主要包括重组痘病毒载体、重组腺病毒载体、重组沙门菌载体、重组李斯特菌载体、其他重组载体等，其中，重组痘病毒载体在山羊疫苗产品研制方面具有显著优势，实现了表达载体与免疫载体的有机融合，既可以激发羊痘病毒的免疫反应，又可以发挥外源蛋白的免疫活性。但是，重组痘病毒载体技术仍存在有待克服的问题。比如，重组痘病毒载体技术普遍采用了标记基因，标记基因技术是随着基因工程发展而兴起的一个研究领域，是对目的基因进行标记的工具，主要包括抗性基因、颜色反应基因、代谢缺陷型互补基因和一些其他具有明显性状表型的相关基因等，其中，eGFP作为一种颜色反应基因常被用于表达产物的精细定位，已被广泛应用于重组病毒的筛选。随着科学技术的不断发展，标记基因技术逐渐成熟，但依然存在诸多弊端，比如，目标转化子被筛选出后，筛选标记即失去了价值，筛选标记的存在反而可能对机体基因表达和正常生命活动造成影响，存在安全隐患。此外，含有标记基因的重组病毒不符合商业疫苗生物安全的要求和基因工程疫苗的种毒标准，易造成基因工程重组活载体疫苗转基因安全问题，疫苗产品的研发及推广应用方面存在局限性。同时，若疫苗产品含有筛选标记，经临床应用后残留在肉制品中，影响肉制品的质量及消费，还有可能引起食品安全恐慌。张倩等(“表达羊传染性脓疱病毒F1L基因的重组山羊痘病毒的构建与特性鉴定”[J].微生物学报,2014,54(7):813-820.)利用同源重组原理，通过脂质体转染技术成功构建了表达羊传染性脓疱病毒F1L基因的重组山羊痘病毒，但存在一定弊端：首先，获得的重组病毒中包含了LacZ筛选标记，仅在筛选重组病毒时起到标记的作用，获得重组病毒后便失去价值，难以达到商品化疫苗标准。然后，利用LacZ筛选标记筛选重组病毒时，需要对染毒细胞进行固定、染色，再进行蓝白斑蚀斑挑选，操作复杂，且易出现假阳性。其次，细胞产生病变是一个动态过程，利用蓝白斑来挑取阳性蚀斑时，收毒时机难以把握，且用于固定的低熔点琼脂糖会干扰蚀斑的观察结果，易错过最佳挑斑时间。因此，开展无筛选标记基因重组病毒的研究是重组病毒疫苗开发的关键。但是，这仍是业界的难题。中国医学科学院病原生物学研究所的郭斐等(一种高效重组且无筛选标记的痘苗病毒载体及其建立方法，CN201910370701.7，2019-07-19.)采用CRISPR-Cas9技术敲出痘苗病毒TK基因，再对痘病毒进行eGFP荧光标记，然后利用Cre-LoxP系统对标记基因进行删除，虽然提高了同源重组效率，但存在以下弊端：(1)CRISPR-Cas9是近年来新兴技术，现阶段主要面临精确修复比较低、PAM识别序列的限制、脱靶现象、马赛克现象等问题，很多方面仍需不断改进和完善；(2)在构建无标记重组痘病毒的过程中，多次利用基因编辑技术后，仍然需要经过多次蚀斑纯化筛选，并未简化病毒纯化过程，而重组病毒的纯化是获得重组病毒的关键。CN102559611A公开了一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒及其构建方法，其中采用同源重组技术和终点稀释法实现构建、筛选无标记重组病毒，但其存在以下弊端：首先，选用的安卡拉牛痘病毒(MVA)载体在人体和大多数哺乳动物细胞中不能有效增殖，选用仓鼠肾细胞(BHK21)进行脂质体转染来构建重组MVA病毒，必然影响同源重组效率，给重组病毒的构建造成困扰；其次，在重组病毒的构建过程中，未对目的基因进行标记，造成重组病毒与亲本毒无法直观的、有效的区分，导致重组病毒的纯化、鉴定十分困难，这也是目前大部分研究构建含有筛选标记基因的重组病毒所要克服的难题，而文中也未给出更有效的解决方案；然后，在重组病毒的纯化过程中，文中将BHK21细胞更换为兔肾细胞(RK-13)，而病毒在新株系细胞上增殖均需要适应期，增加了病毒纯化的难度，且采用终点稀释法获得重组病毒需要更大的工作量，易出现假阳性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服ORFV重组山羊痘病毒含有筛选标记问题，并开发新型防ORF候选疫苗毒株。本专利技术的目的是这样实现的：一种重组病毒，其特征在于所述病毒无筛选标记，采用同源重组与反向蚀斑相结合。上述重组病毒，采用带有目的基因的质粒与带有筛选标记的病毒载体进行同源重组，目的基因替代病毒载体中的筛选标记，进行反向蚀斑筛选并纯化。具体的，专利技术人将上述重组病毒技术应用于ORFV疫苗产品开发，构建重组山羊痘病毒活载体，获得一种稳定表达羊口疮病毒F1L蛋白的无筛选标记重组山羊痘病毒。优选的，上述质粒为pUC19-lateP-earlyP-F1L质粒(图1)，病毒载体为rGTPV-eGFP。类似的质粒包括：pUC119、pUC18、pUC118等，类似的病毒包括：绵羊痘病毒等。上述述重组病毒、制备方法可应用于无筛选标记重组山羊痘病毒的构建。所述目的基因为F1L，所述重组病毒为无筛选标记重组山羊痘病毒rGTPV-F1L。类似的目的基因包括B2L等。上述筛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组病毒，其特征在于：所述重组病毒无筛选标记，采用同源重组与反向蚀斑筛选相结合。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组病毒，其特征在于：所述重组病毒无筛选标记，采用同源重组与反向蚀斑筛选相结合。


2.如权利要求1所述的重组病毒的制备方法，采用带有目的基因的质粒与带有筛选标记的病毒进行同源重组，目的基因替代病毒中的筛选标记，进行反向蚀斑筛选纯化。


3.如权利要求2所述重组病毒的制备方法，所述质粒为pUC19-lateP-earlyP-F1L质粒，所述病毒为rGTPV-eGFP。


4.如权利要求1-3任一所述重组病毒的制备方法应用于无筛选标记重组山羊痘病毒的构建。


5.一种无筛选标记重组山羊痘病毒，采用权利要求2或3所述方法构建，所述目的基因为F1L，所述重组病毒为无筛选标记重组山羊痘病毒rGTPV-F1L。


6.如权利要求5所述无筛选标记重组山羊痘病毒，所述筛选标记为eGFP。


7.如权利要求5或6所述的重组山羊痘病毒，将pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒与接种了病毒载体rGTPV-eGFP的细胞进行转染，通过二次同源重组，将F1L基因序列插入并替代rGTPV-eGFP重组羊痘病毒中的eGFP基因序列，利用反向蚀斑筛选纯化不表达绿色荧光蛋白的蚀斑。


8.如权利要求5-7任一所述的重组山羊痘病毒，所述pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒的制备方法包括以下步骤：使用F1L-F/F1L-R为引物扩增ORFV的F1L全长基因序列，通过双酶切，插入并替代pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒中的eGFP序列，获得pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒。


9.如权利要求8所述的重组山羊痘病毒，所述F1L-F的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，F1L-R的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示。


10.如权利要求5-9任一所述的重组山羊痘病毒，所述rGTPV-eGFP的制备方法包括以下步骤：利用脂质体转染技术，将重组质粒pUC19-lateP-earlyP-eGFP转染接种了羊痘弱毒疫苗株的BHK21细胞后，通过同源重组和蚀斑筛选技术，获得稳定表达绿色荧光蛋白的rGTPV-eGFP。


11.如权利要求10所述的重组山羊痘病毒，所述rGTPV-eGFP...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国洋，杨柳，余远迪，沈克飞，付利芝，白运川，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：重庆;50