一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体及其构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种重组人源化PD‑1和c‑Met双特异性抗体及其构建方法。本发明专利技术在计算机分子结构模拟的基础上，利用分子克隆技术以筛选的两株单克隆抗体为模板，构建双特异性抗体的表达质粒，该表达质粒为四价双特异性抗体，能够识别肿瘤细胞表面的c‑Met并且阻断T细胞表面的负性共刺激分子PD‑1与肿瘤细胞表面的PD‑L1的结合，使T细胞对肿瘤细胞产生持续性的杀伤作用，为靶向c‑Met阳性肿瘤细胞的免疫干预提供基础。

A bispecific antibody against PD-1 and c-Met antigens and its construction method

【技术实现步骤摘要】
一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体及其构建方法
本专利技术属生物
，涉及一种双特异性抗体及其构建方法，具体涉及一种重组人源化PD-1&c-Met双特异性抗体及其构建方法。
技术介绍
现有技术公开了T细胞是机体免疫系统抗肿瘤免疫应答的核心，它的完全活化有赖于双信号和细胞因子的共同作用。程序性死亡受体(programmedcelldeath-1，PD-1)，属于T细胞活化所需第二信号中的负性共刺激分子，与其配体PD-L1，PD-L2结合后能够下调CD3(CD28)诱导的磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶B的活性，抑制T细胞增殖相关基因的转录并促进其凋亡；同时还招募蛋白酪氨酸磷酸酶1(ProteinTyrosinePhosphatase-1，PTP-1)，使结合的分子去磷酸化，抑制T细胞的增殖与活化，从而减少T细胞的免疫应答，有利于维持自身免疫耐受；研究显示，肿瘤细胞也正是利用了该一点，通过在其表面表达PD-L1来沉默T细胞的功能，从而逃避免疫监视。肿瘤的靶向治疗是在细胞分子水平上，针对肿瘤和正常组织表面分子表达的差异，设计相应的抗肿瘤药物，该药物进入体内将特异性地杀伤肿瘤细胞，而不会波及周围正常组织，能最大程度地减少传统的放疗，化疗等治疗措施会产生的毒副作用。肝细胞生长因子受体(hepatocytegrowthfactorreceptor，HGFR)，又名c-Met，由原癌基因c-Met编码，具有酪氨酸激酶活性，与其配体HGF结合后能够促进细胞的增殖与分化，研究表明，c-Met与多种肿瘤发生与转移密切相关，且在众多肿瘤病人体内发现了c-Met的过度激活，而在正常组织中几乎没有活性。传统的单克隆抗体一般是通过结合肿瘤细胞表面异于正常细胞的抗原引起细胞的凋亡，还可以激活补体系统达到杀伤肿瘤细胞的目的，但是其无法招募T细胞来对对抗肿瘤的缺点使它的应用受到一定限制。双特异性抗体(bispecificantibody，BsAb)，可以同时特异性结合两个不同的抗原，早在30年以前就被研发，因受限于生产技术加之临床试验失败故未能继续研究；近几年基因工程技术的发展为免疫原性较低的人源化双特异性抗体的开发提供了新的机遇，双特异性抗体主要特点是同时结合肿瘤细胞表面抗原和免疫效应细胞表面抗原，阻断双靶点的信号传递，并且能够直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。目前在研的大多数双特异性抗体均选择了T细胞表面的CD3作为效应细胞上的靶点，若干研究表明使用CD3双抗治疗后，T细胞表面的PD-1以及肿瘤细胞表面的PD-L1的表达水平均有升高，PD-1/PD-L1通路的持续激活将抑制T细胞的功能，从而减弱其杀伤肿瘤细胞的作用；目前，普遍采用的非对称结构的双特异性抗体存在有如下缺陷，如，在自体组装时常出现有轻重链错配的现象，而小分子的双特异性抗体结构不稳定，缺乏Fc区域，导致其半衰期短，在体内容易被清除，难以达到有效治疗肿瘤的目的，等等。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体，可克服现有技术中的单一识别或者识别后引起的免疫抑制作用所导致的在肿瘤治疗中疗效不足的问题，以及抗体结构不稳定或者装配效率低下等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体，尤其是，基于现有技术中的单一识别或者识别后引起的免疫抑制作用所导致的在肿瘤治疗中疗效不足的问题以及抗体结构不稳定或者装配效率低下等问题，本专利技术公开了一种能够同时结合肿瘤相关抗原c-Met和免疫检查点分子PD-1的四价双特异性抗体，与抗c-Met抗体的联合给予了PD-1抑制剂靶向c-Met阳性肿瘤细胞的能力，由此降低脱靶的几率，对正常组织的副作用相应降低，且此双特异性抗体可以随时阻断PD-1/PD-L1抑制性通路，产生持续性的杀伤肿瘤细胞的作用。具体的，本专利技术提供了一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体，其包含：特异性识别T淋巴细胞的PD-1抗原的第一抗体段和特异性识别肿瘤细胞c-Met抗原的第二抗体段。本专利技术中，所述的双特异性抗体的轻链单元为：抗PD-1抗体的轻链可变区与轻链恒定区，所述的双特异性抗体的重链单元为：由抗c-Met抗体的轻链可变区与重链可变区通过Gly4Ser连接肽构成c-MetscFv区，将此scFv区通过Gly4Ser连接肽序列连接到抗PD-1抗体重链单元的C末端，形成所述的双特异性抗体的重链单元；本专利技术中，所述抗PD-1抗体的轻链单元的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述抗PD-1抗体的重链单元的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，所述抗c-Met抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述抗c-Met抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，所述Gly4Ser连接肽的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。本专利技术的抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体通过以下方法制备：(1)将所述的重、轻链分别构建到同种表达载体中；(2)将(1)构建的两个表达载体一起共转染到宿主细胞中，培养并分离上清；(3)将分离的上清纯化，得PD-1&c-Met双特异性抗体IgG-scFv。本专利技术中，所述表达载体为pCEP4。本专利技术中，所述宿主细胞为经EBNA1改造的人胚肾293细胞HEK293E。本专利技术进行了乳酸脱氢酶检测双特异性抗体IgG-scFv对肿瘤细胞的杀伤作用实验，双特异性抗体IgG-scFv促进T细胞分泌细胞因子的作用实验，检测了双特异性抗体IgG-scFv对肿瘤细胞增殖的抑制作用和对c-Met下游信号通路的作用，以及双特异性抗体IgG-scFv在NOD-SCID皮下荷瘤小鼠模型中的作用实验，经试验表明所述的双特异性抗体，能够识别肿瘤细胞表面的c-Met并且阻断T细胞表面的负性共刺激分子PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1的结合，使T细胞对肿瘤细胞产生持续性的杀伤作用。进一步，本专利技术提供了所述的抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体在制药物中的用途；所述的药物为在治疗或预防c-Met特异性抗原表达的肿瘤药物。本专利技术在计算机分子结构模拟的基础上，利用分子克隆技术以筛选的两株单克隆抗体为模板，构建双特异性抗体的表达质粒，该表达质粒为四价双特异性抗体即重组人源化PD-1和c-Met双特异性抗体，经试验表明，能够识别肿瘤细胞表面的c-Met并且阻断T细胞表面的负性共刺激分子PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1的结合，使T细胞对肿瘤细胞产生持续性的杀伤作用，本专利技术为靶向c-Met阳性肿瘤细胞的免疫干预提供了基础。本专利技术中使用下述术语和缩略语：PD-1：程序性死亡受体1(programmedcelldeath-1)c-Met：肝细胞生长因子受体(mesenchymalepithelialtransitionfactor)HGF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体，其特征在于，其包含：特异性识别T淋巴细胞的PD-1抗原的第一抗体段和特异性识别肿瘤细胞c-Met抗原的第二抗体段。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体，其特征在于，其包含：特异性识别T淋巴细胞的PD-1抗原的第一抗体段和特异性识别肿瘤细胞c-Met抗原的第二抗体段。


2.根据权利要求1所述的抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体，其特征在于，该双特异性抗体的轻链单元为抗PD-1抗体的轻链可变区与轻链恒定区，该双特异性抗体的重链单元为：由抗c-Met抗体的轻链可变区与重链可变区通过Gly4Ser连接肽构成c-MetscFv区，将此scFv区通过Gly4Ser连接肽序列连接到抗PD-1抗体重链单元的C末端，形成所述的双特异性抗体的重链单元；其中，抗PD-1抗体的轻链单元的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，抗PD-1抗体的重链单元的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，抗c-Met抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，抗c-Met抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，Gly4Ser连接肽的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。


3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：于敏，侯维花，莫炜，王羽雄，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31