本发明专利技术公开了检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒及多肽配体。本发明专利技术所提供的多肽配体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。本发明专利技术所提供的检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含序列表中序列1所示的多肽配体。本发明专利技术所提供的试剂盒较Bender?MedSystems?sCD40L?ELISA试剂盒具有更好的灵敏度和特异性，其对ACS的临床诊断及病情监测具有重要的应用价值。本发明专利技术的试剂盒采用的是化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，为临床心脑血管病特别是ACS临床诊断及病情监测提供了一种新的检测产品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒及多肽配体。
技术介绍
近年研究提示炎症与免疫在动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的发生、发展中起重要作用，提示动脉粥样硬化可能是一种慢性炎症性疾病。研究发现，白细胞分化抗原40(CD40)信号通路参与了动脉粥样硬化斑块内主要细胞成分(血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及巨噬细胞)的炎症反应的调节，参与了动脉粥样硬化的发生和发展。存在于动脉粥样硬化斑块内的细胞通过⑶40-⑶40配体相互作用，导致自身活化,表达和分泌有利于免疫 应答发生、炎症反应、血凝和血栓形成的蛋白质细胞因子，而最终导致粥样硬化斑块病变的恶化。CD40配体(CD40L)可激活在动脉粥样硬化斑块中的关键性细胞成分，如黏附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶(MMPs)、组织因子等的产生，导致斑块的不稳定和破裂。在AS的免疫反应调节中CD40-CD40配体的相互作用非常重要，它们的相互作用显著影响AS相关细胞的功能，并且与斑块的发生发展密切相关。⑶40L也称Pg39、⑶154，由261个氨基酸组成的II型跨膜蛋白，其三维结构类似于肿瘤坏死因子α (TNF-α )，属于TNF家族细胞因子。主要表达于活化的⑶4+T细胞表面。近年发现，除了 T细胞，⑶40L还表达于B细胞、自然杀伤细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞以及非造血系统起源的内皮细胞等。血小板在激活中表达⑶40L，并在激活后数分钟至数小时降解为可溶性白细胞分化抗原40配体(s⑶40L)。s⑶40L可通过促进血小板-单核细胞聚集和产生活性氧自由基维持炎症反应，其在动脉粥样斑块形成过程中的作用目前已经在研究中证实，急性冠状动脉综合症(ACS)病人的SCD40L值较正常人又明显升高，这预示着SCD40L水平对ACS临床诊断及病情监测具有一定意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种多肽配体。本专利技术所提供的多肽配体，其氨基酸序列如序列表中序列I所示。本专利技术的另一个目的是提供一种检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒。本专利技术所提供的检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含所述的多肽配体。所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的s⑶40L单克隆抗体。所述试剂盒还包括已知浓度的重组全长⑶40L抗原稀释液作为标准品。所述试剂盒还包括鲁米诺作为化学发光体系的底物，对碘苯酚作为发光增强剂。本专利技术的又一个目的是提供一种检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的制备方法。本专利技术所提供的检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤将所述多肽配体按终浓度O. 5 μ g/ml、l. O μ g/ml或2. 0 μ g/ml加入到2OmmoIpH4. O醋酸盐缓冲液或20mmol pH7. 4磷酸盐缓冲液或50mmol pH9. 6碳酸盐缓冲液中混勻后,加入化学发光板内，每孔100 μ 1，4°C温浴16-22小时，弃去孔内液体后加入含有牛血清白蛋白或胎牛血清的20mmol pH7. 4的磷酸盐缓冲液120 μ 1，37°C下静置2小时后，弃去孔内液体，干燥发光板，得到包被多肽配体的板条。所述方法还包括以下步骤将s⑶40L单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记。所述方法还包括以下步骤将重组全长⑶40L抗原用蛋白稳定剂稀释成6个梯度浓度，分别为 Ong/ml、I. 0ng/ml、2. 5ng/ml、5. Ong/ml、10. Ong/ml 和 20. Ong/ml。 所述方法还包括以下步骤制备化学发光底物液A液和B液用超纯水中配制O. lmol/L pH8. 2-8. 7的Tris-HCl缓冲液，加入终浓度为3mmol/L的鲁米诺、O. 3mmol/L的Tween20和碘苯酹混合溶液,作为A液；用超纯水配制的O. lmol/L pH4. 4-4. 8的柠檬酸缓冲液，加入终浓度为30%的H2O2溶液，作为B液。所述多肽配体在制备检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的检测方法如下(I)自2-8°C冰箱中取出所述试剂盒，室温平衡30分钟。(2)取出包被板条，插入发光板架上。(3)将 6 个标准品(浓度分另Ij 为 Ong/ml、l. 0ng/ml、2. 5ng/ml、5. 0ng/ml、10. Ong/ml和20. Ong/ml)及待检测样本加入发光板中，每孔100 μ I。振荡混匀后贴上封板膜，置于37°C温育30分种。(4)甩去反应液，每孔加满稀释后的磷酸盐洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。(5)加入HRP标记的s⑶40L抗体试剂，每孔100 μ LI。振荡混匀后贴上封板膜，置于37°C温育20分种。(6)甩去反应液，每孔加满稀释后的磷酸盐洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。(7)使用前将化学发光底物液A和B等体积混合，每孔加入100 μ I的化学发光底物混合液，振荡混合均匀，置于室温避光反应5分钟。(8)将化学发光板在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)。(9)根据标准品的浓度与发光强度(RLU)建立标准曲线，以标准品浓度为横坐标，发光强度(RLU)值为纵坐标，在坐标系中标出6个标准品的散点图，采用回归方式建立标准曲线(要求相关系数R2 > O. 99)和曲线方程。根据待测样品的发光强度(RLU)反推计算出样品的s⑶40L浓度。(10)以样品中SCD40L浓度5. 00ng/ml为临界值，判定ACS临床诊断及病情监测的预警提示。本专利技术通过构建可溶性白细胞分化抗原40配体(s⑶40L)的多肽配体库，采用酶联免疫法(ELISA)筛选，进一步确定具有较高效价的多肽配体。SCD40L的多肽配体的应用主要表现在可用于检测血清中S⑶40L的含量，包括化学发光法等。本专利技术所提供的试剂盒较Bender MedSystems sQ)40L ELISA试剂盒具有更好的灵敏度和特异性，其对ACS的临床诊断及病情监测具有重要的应用价值。本专利技术的试剂盒采用的是化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，为临床心脑血管病特别是ACS临床诊断及病情监测提供了一种新的检测产品。附图说明 图I为化学发光免疫试剂盒对不同对象的检测结果。具体实施例方式实施例I、⑶40L多肽配体库的建立采用生物信息学分析，结合TOB中CD40L数据进行分析，进一步确定了能够与CD40L结合的潜在的多肽配体所具有的元件序列主要包括Glu\Tyr\Gln\Leu-Tyr\Ser-Glu\Leu-Glu\Thr-Ser-Glu-Glu\Lys\Tyr-Glu\Tyr\Gln\Leu-Asp\Glu-Glu\Lys\Tyr-Tyr\Ser-Glu\Leu进行兼并分析后，提交上海生工生物技术有限公司辅助合成多肽片段Glu-Tyr-Glu-Glu-Ser-Glu-Lys-Glu-Asp-Glu-Tyr-Glu (序列表中序列 I)要求合成的多肽纯度> 90%。实施例2、⑶40L多肽配体库的筛选多肽配体库的筛选采用ELISA法进行，具体方法如下①s⑶40L的标记。采用改良的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽配体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：段旭，焦守恕，李全，
申请(专利权)人：同昕生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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