本发明专利技术公开了一种具有促成骨生长的生物活性多肽及其制备方法，氨基氨基序列满足下列通式中的任意一种：Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2、Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-DGRGDSVAYG-CONH2和Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-G-PRGDSGYRGDS-CONH2；所述的多肽采用固相合成法合成。本发明专利技术可以让营养物资、生物活性分子和氧气到达所种植的细胞，生物相容性良好，突破了来源的限制，成骨生长肽能显著促进成骨分化和新生骨的形成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及促成骨生长的生物活性多肽，属于生物技术多肽及医用材料领域。
技术介绍
再生医学和组织工程需要两个关键因素对机体无毒、生物相容性良好的支架材料和能有效代替受伤组织而没有副反应的适宜细胞，包括各种干细胞和祖原细胞。因此，选择适当而有效的生物活性支架来刺激和促进细胞分化，支持组织再生是组织工程的关键问题。1992年，美国麻省理工学院的张曙光偶然从酵母蛋白中发现了能自组装的离子短肽，该离子短肽是由8 16个氨基酸构成的自组装体系，可作为细胞培养支架材料。与其他生物医学材料相比，自组装多肽孔径约5-500nm，这样的纤维网状支架材料类似于细胞外基质，有利于细胞的黏附和生长；自组装多肽材料形成的水凝胶含水量大于99%，表面积非常 大，可以让营养物质、生物活性分子和氧气到达所种植的细胞；自组装多肽材料成分简单，生物相容性良好，因其在体内的降解产物为氨基酸，可被生物体吸收或代谢而无毒副作用。多肽分子自组装技术在为生物医学材料及其它领域显示出巨大的潜力，研究多肽自组装有助于更好的研究生命现象，并在微观分子水平设计新材料。通过改变氨基酸排列顺序可设计合成具有不同结构的分子自组装体，以发挥支架材料最好的功能特性。离子型多肽具有性质截然不同的两个表面，一个亲水面,一个疏水面,它们交替排列，像积木块的楔和孔一样，代表性的多肽如EAK16和RADA16等。疏水性氨基酸Gly可由Leu、Ile、Ala、Val或Tyr替代，以增强其机械强度，更适应某种特定的硬性组织工程或组织修复，如骨组织工程。成骨生长肽(ALKRQGRTLYGF)是骨组织修复中成骨生长的一个关键因素。生理状态下成骨生长肽(OGP)主要以结合形式，即OGP-OGP结合蛋白(OGPBP)复合物的形式大量存在于人和哺乳动物的血清中。体外实验中，成骨生长肽能显著促进新生骨形成，明显增加成骨活性蛋白碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的浓度水平，当应用于体内实验时，成骨生长肽刺激骨生成和血细胞生成。1979年Senger等首次报道与恶性转化有关的一种包含RGD整合素结合区的磷酸化糖蛋白与肿瘤的关系，称之为转化相关性磷酸蛋白，后将其命名为骨桥蛋白OPN。OPN是由前成骨细胞、成骨细胞和骨细胞合成的，分泌到前骨质中形成骨。成骨细胞可合成44kDa的高磷酸化蛋白，能调节羟基磷灰石晶体生长，因此，OPN被认为是成骨细胞成熟分化的标志。其相对分子质量约为44kDa，约含300个氨基酸残基，其中Arg-Gly-Asp (RGD)占有很高的比例。OPN通过依赖RGD序列(ανβ1、ανβ3、ανβ5、ανβ1、α8β1)和非依赖RGD序列(α4β1、α 9 β I)结合存在于细胞表面上的多种整合素受体，起细胞粘附作用。目前使用的人工合成的ECM替代物大多为聚合物(polymer)。聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)是最常用的两种支架材料。近来聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(PLGA)得到了深入的研究。具生物活性的玻璃陶瓷、羟基磷灰石(HAP)、钙磷陶瓷，即羟基磷灰石和磷酸三钙(HA/TCP)也可用于骨组织工程。公开号为CN101496911A的中国专利公开了一种在脱钙骨基质上交联肝素所得的骨支架材料，由于其是由哺乳动物的骨经脱钙再交联而得，所以来源有限，且受其生物相容性的限制。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供连接生物活性多肽的具有促进骨生长活性的新型结构多肽，微观方面，该类多肽的氨基酸残基间通过非共价键相互作用自发组合形成的一类结构明确，构造稳定的分子聚集体或超分子结构。宏观方面，该类多肽溶于总盐离子(含Na、K、Ca、Mg和Cl)浓度彡ImM的水溶液时形成含水量大于99%的水凝胶，可应用于组织工程。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是三种合成多肽中的任意一种，其氨·基氨基序列分别满足通式Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2 ； Ac- (X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3) n_GG_DGRGDSVAYG-CONH2 ；Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-G-PRGDSGYRGDS-CONH2 ；其中，Ac为乙酰化N端，X1为L-氨基酸，氨基类型为疏水性氨基酸Leu (亮)、Ile (异亮)、Ala (丙)、Gly(甘)或Val (缬)；X2 SL-氨基酸，氨基类型为带负电荷的酸性氨基酸Asp (天冬)或Glu (谷)；X3为L-氨基酸，氨基类型为带正电荷的碱性氨基酸Lys (赖)、Arg (精)或His(组)；X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3为重复序列，η为氨基酸重复序列的重复次数，η=1或2 ;(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n重复序列的C端连接I或2个Gly，防止后续连接的生物活性肽影响重复序列的自组装；在Gly的C端连接三种不同的生物活性肽成骨生长肽、细胞粘附因子和含两个DGR氨基序列的PRG，氨基序列分别为ALKRQGRTLYGF、DGRGDSVAYG和PRGDSGYRGDS。本专利技术提供上述多肽的合成方法，合成的多肽可以采用固相合成法合成，包括但不限于Fmoc-SPPS方式、BOC-SPPS方式、片段缩合连接方式。采用Fmoc-SPPS方式固相合成技术合成上述三种多肽包括以下步骤树脂采用Fmoc-Amide-Wang Resin,置于反应柱,加入无水二氯甲烧浸没树脂，浸泡溶胀30min后抽干，二甲基甲酰胺溶液洗涤。用质量百分比为20%的六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液作为脱帽液，脱除氨基的Fmoc保护基，采用多肽合成仪或者手工合成多肽的方式，由C端向N端分步偶联专利技术通式所述的所有氨基序列，采用I. 5倍树脂摩尔量的HOBT或TBTU活化氨基酸的羧基，I. 5-3倍树脂摩尔量DIC (N, N- 二异丙基碳二亚胺)作为反应催化剂。称取Fmoc-氨基酸-0H，TBTU或TBTU，六氢吡啶(摩尔量比=1 I. 5 I)溶于等摩尔量20%DMF的混合液中，加入I. 5-3倍树脂摩尔量DIC催化反应进行。依次连接Fmoc-氨基酸-0H，使用Kaiser方法检测每步是否连接完全，直至氨基序列全部完成。在最后一个Fmoc-氨基酸-OH脱保护后，加入I. 2-2倍树脂摩尔量的乙酸酐吡啶二甲基甲酰胺=2:1:3(V:V)的混合溶液，摇荡30分钟，对裸露的氨基进行乙酰化保护，成为多肽树脂。甲醇洗涤3次，把树脂抽干，由于含Tyr，易产生副反应，采用10-15mL/g树脂的TFA混合液(体积百分比为95:1:2:2的TFA、TIS、EDT和H2O)切割2_4小时。导入3_6倍混合液体积的冰乙醚进行沉淀，离心2_4次收集沉淀，真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体即粗品，-20°C保存。经过高效液相色谱(HPLC)分离纯化收集主峰，色谱柱SpheriSOrb3-C18，粒径 5 μ m，孔径300 A,流动相A，O. 1%TFA/H20 ；B, 0. 1%TFA/ACN,洗脱梯度，10%B—65%B。冷冻干燥得到纯度95%以上的多肽粉末。本专利技术还将上述多肽进行自组装获得水凝胶，可用于细胞培养，有望用于组本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有促成骨生长的生物活性多肽，其特征在于：氨基氨基序列满足下列通式中的任意一种：Ac?(X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3)n?GG?ALKRQGRTLYGF?CONH2；Ac?(X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3)n?GG?DGRGDSVAYG?CONH2；Ac?(X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3)n?G?PRGDSGYRGDS?CONH2；其中，Ac为乙酰化N端，X1为L?氨基酸，氨基类型为疏水性氨基酸：Leu、Ile、Ala、Gly或Val；X2为L?氨基酸，氨基类型为带负电荷的酸性氨基酸：Asp或Glu；X3为L?氨基酸，氨基类型为带正电荷的碱性氨基酸：Lys、Arg或His；X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3为重复序列，n为氨基酸重复序列的重复次数，n=1或2；(X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3)n重复序列的C端连接1或2个Gly；在Gly的C端连接三种不同的生物活性肽成骨生长肽、细胞粘附因子和含两个DGR氨基序列的PRG，氨基序列分别为ALKRQGRTLYGF、DGRGDSVAYG和PRGDSGYRGDS。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢婷利，陈婷，马玉樊，校月红，李昱辉，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：
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