滇南臭蛙天然抗氧化肽的改造体及其制备方法及应用，改造体包括两种：OA-OTVC和OA-OTC，均是直链小肽，分别含有16、14个氨基酸残基，分子量为1688.06?Da、1489.79Da?，等电点为9.85、9.62。多肽全序列一级结构为：OA-OTVC：缬氨酸-缬氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸；OA-OTC：赖氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸。该改造体抗氧化活性好，分子量小，结构简单，可以用于制备抗氧化药物、食品添加剂、化妆品等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供两种来源于滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)的天然抗氧化肽的改造体0A-0TVC、OA-OTC及其制备方法、应用，属于生物医学
技术介绍
自由基指任何包含一个未成对电子的原子或原子团。生物体与外界接触和自身产生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、脂质过氧自由基、二氧化氮、一氧化氮自由基、单线态氧和臭氧。在较高浓度下，活性氧自由基对生物细胞的细胞结构、核酸、脂类和蛋白质造成损伤。造成DNA损伤，进一步引起复制错误、基因组不稳定、转录意外起始或终止，从而导致生物体变异或疾病发生；引起细胞膜流动性和通透性改变，导致细胞结构和功能改变；引起蛋白质氧化，导致蛋白质变性和失活。 目前发现，活性氧自由基与多种人类疾病有关,如癌症、心脑血管疾病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和衰老等。为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中生物体形成多种不同的自由基清除系统，包括非基因编码的小分子物质，如尿酸、维生素C、维生素E、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶Q等；基因编码的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白酶系统和谷胱甘肽酶系统；基因编码的小分子抗氧化肽类，如从两栖类蛙科动物皮肤中发现的各种小分子抗氧化多肽。各种不同类型的自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力，如维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。我国拥有丰富的两栖类动物资源，它是中国生物资源的重要组成部分，其中很多物种具有食用或药用等价值，具有很大的开发利用潜力。两栖动物由于长期生活在潮湿、阴暗、微生物大量滋生的环境下，在长期自然进化过程中形成了三套防御机制(1)物理屏障，粘液腺分泌大量糖蛋白和蛋白聚糖，包裹在皮肤外表面，阻碍病原菌的侵入；(2)获得性免疫系统，两栖动物皮肤中含有抗体IgG ; (3)先天免疫系统，主要由大量的抗菌肽和抗氧化肽构成。我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质的研究还鲜有报道。滇南臭蛙(Odorrana tiannanensis)属于两栖纲无尾目娃科娃属，为中国的特有物种,分布于海南、云南等地，多生活于阴暗的水流湍急的山涧中。该物种的模式产地在云南河口。目前关于滇南臭蛙形态、发育和分子进化已有报道，关于滇南臭蛙来源的天然抗菌-抗氧化多功能肽，我们前期工作已有报道。本专利技术的滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)的天然抗氧化肽的改造体0A-0TVC.0A-0TC,分子量小，结构简单，为线性分子，方便化学合成及基因工程制备。相比较已报道的其他抗氧化肽及改造前体，0A-0TVC、0A-0TC的抗氧化性更强，对DPPH，ABS自由基均具有极强的还原性，因此可以成为开发抗氧化药物、食品添加剂、化妆品有效成分的优良模板。
技术实现思路
本专利技术提供两种具有很强的抗氧化能力的，来源于滇南臭蛙(Odorranatiannanensis)天然抗氧化肽的改造体0A-0TVC、OA-OTC及制备方法及应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为改造体OA-OTVC : —种直链小肽，含有16个氨基酸残基，分子量为1688. 06 Da,等电点为9. 85 ;其多肽全序列一级结构为缬氨酸-缬氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸；改造体OA-OTC :—种直链小肽，含有14个氨基酸残基，分子量为1489. 79Da，等电点为9. 62 ;其多肽全序列一级结构为赖氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸。根据二者的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列；通过HPLC反相·柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95% ;用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其分子量。改造体抗菌肽的应用，所述改造体抗菌肽用于制备抗氧化药物、食品添加剂、化妆品有效成分的用途。本专利技术的有益效果在于本专利技术根据滇南臭娃天然抗氧化肽odorranain-A-OT的氨基酸序列，利用分子改造方法设计odorranain-A-OT的改造体0A-0TVC、0A-0TC,该改造体具有极强的抗氧化活性，此外具有分子量小、结构简单、制备方法简单等有益特点。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例I来源于滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)天然抗氧化肽的改造体0A-0TVC、0A-0TC的化学制备方法I、0A-0TVC、0A-0TC 的制备方法根据滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)天然抗氧化肽改造体0A-0TVC、0A-0TC的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A，AppliedBiosystems)合成其全序列,利用HPLC反相柱层析脱盐。II、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)。III、纯化的0A-0TVC、0A-0TC用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。测定结果为0A_0TVC、0A-0TC是滇南臭娃滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)天然抗氧化肽odorranain-A-OT的两种变异体。0A-0TVC、0A-0TC其均是直链多肽，分别含有16、14个氨基酸残基，分子量分别为1688.06 Da、1489. 79Da，等电点分别为9. 85、9. 62。。0A-0TVC全序列为缬氨酸-缬氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸；0A-0TC全序列为赖氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸。 实施例2 OA-OTVC, OA-OTC的抗氧化活性实验I. DPPH自由基清除活性称取一定量的DPPH (2，2' - 二苯代苦味酰基苯肼)，用甲醇溶解，配成6 X 10_5 M的溶液，现配现用。将92 μ I DPPH溶液和8 μ I样品(0A-0TVC、OA-OTC, 2 mg/ml)混合，分别在室温下避光静置30 min，并分别于517 nm处测定吸光值。空白对照组以样品溶解介质代替待测样品。实验做三个平行，紫外分光光度计调零时使用甲醇。DPPH·清除率(%) = (AB — AA)/ABX100 (AB:空白对照组吸光值；AA:样品组吸光值)。表I. DPPH抗氧化活性权利要求1.滇南臭蛙天然抗氧化肽的改造体，其特征在于，该改造体包括两种=OA-OTVC和OA-OTC OA-OTVC :ー种直链小肽，含有16个氨基酸残基，分子量为1688. 06 Da，等电点为9. 85 ；其多肽全序列一级结构为缬氨酸-缬氨酸-赖氨酸-半胱本文档来自技高网...
【技术保护点】
滇南臭蛙天然抗氧化肽的改造体，其特征在于，该改造体包括两种：OA?OTVC和OA?OTC：OA?OTVC：一种直链小肽，含有16个氨基酸残基，分子量为1688.06?Da，等电点为9.85；其多肽全序列一级结构为缬氨酸?缬氨酸?赖氨酸?半胱氨酸?丝氨酸?半胱氨酸?精氨酸?脯氨酸?甘氨酸?丝氨酸?脯氨酸?丙氨酸?脯氨酸?精氨酸?半胱氨酸?赖氨酸；OA?OTC：一种直链小肽，含有14个氨基酸残基，分子量为1489.79Da?，等电点为9.62；其多肽全序列一级结构为：赖氨酸?半胱氨酸?丝氨酸?半胱氨酸?精氨酸?脯氨酸?甘氨酸?丝氨酸?脯氨酸?丙氨酸?脯氨酸?精氨酸?半胱氨酸?赖氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于海宁，王义鹏，广慧娟，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：
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