用于治疗癌症的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及抑制可溶性人CD39的酶活性的抗原结合化合物。本发明专利技术还涉及产生此类化合物的细胞；制备此类化合物和其抗体、片段、变体和衍生物的方法；包括所述化合物的药物组合物；使用所述化合物诊断、治疗或预防疾病，例如癌症的方法。

Composition and method for cancer treatment

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗癌症的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年3月16日提交的美国临时申请第US62/471,994号和2017年11月15日提交的第US62/586,220号的权益；两者均通过引用以其整体并入本文；包含任何附图。序列表参考本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以2018年3月15日创建的名为“CD39-6_ST25”的文件提供，其大小为53KB。序列表的电子格式的信息通过引用以其整体并入本文。
本专利技术涉及抑制可溶性人CD39的酶活性的抗原结合化合物(例如抗体)。本专利技术还涉及产生此类化合物的细胞；制备此类化合物和其抗体、片段、变体和衍生物的方法；包括所述化合物的药物组合物；使用所述化合物诊断、治疗或预防疾病，例如癌症的方法。
技术介绍
八种不同的ENTPD基因编码NTPDase蛋白质家族的成员。各个NTPDase亚型的细胞位置和功能特性不同。质膜结合的核苷三磷酸二磷酸水解酶通过水解核苷酸的c和b磷酸控制细胞表面的核苷酸水平。NTPDase1(胞外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1)，也称为CD39/ENTPD1或血管CD39，与另一种酶CD73(胞外-5'-核苷酸酶)共同作用，以水解细胞外三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)，生成腺苷，其结合腺苷受体并抑制T细胞和自然杀伤(NK)细胞反应，从而抑制免疫系统。通过CD73/CD39途径生成腺苷被认为是调节性T细胞(Treg)免疫抑制功能的主要机制。CD39+Treg的数量在一些人类癌症中增加，并且CD39+Treg在促进肿瘤生长和转移中的重要性已经使用几个体内模型得到证实。然而，CD39也被肿瘤细胞表达，并且CD39+肿瘤细胞可以通过腺苷途径介导免疫抑制。癌细胞中的CD39显示ATP酶活性，并且与CD73一起生成腺苷。CD73+CD39+癌细胞以CD39依赖性和腺苷依赖性方式抑制CD4和CD8T细胞的增殖以及细胞毒性效应CD8T细胞(CTL)的生成。已经报道CD39在几种实体瘤(结肠直肠癌、头颈癌、胰腺癌)以及慢性淋巴细胞白血病中增加。在WO2009/095478中公开了结合并抑制CD39表达性细胞中的CD39的抗体。抗体“A1”(eBiosciences，Inc.)用于染色应用，并且未显示出中和细胞中CD39活性的能力。Hayes等人，(2015)《美国转译研究期刊(Am.J.Transl.Res.)》7(6):1181-1188利用结合FcγR并具有效应子功能的抗CD39，但所述CD39据称也被阻断。CD39在不同细胞类型，包含白细胞和肿瘤细胞上的表达，结合使用不实际上阻断CD39或不是纯阻断剂的抗体，为评估抗体的潜在活性创造了复杂的环境。迄今为止，唯一报道过的CD39活性位点的抑制剂仍为小分子不可水解的ATP类似物，例如ARL67156，表明需要直接抑制活性位点。然而，ARL67156不是CD39特异性的，并且还抑制其它NTPDase，如NTPDase1、NTPDase3、NPP1或小鼠NTPDase8，并且更进一步仅作为弱竞争性抑制剂(Levesque等人(2007)《英国药理学杂志(Br.J.Pharmacol.)》152:141-150)。CD39在N-和C-末端附近具有两个跨膜结构域、短的胞质N-和C-末端片段、以及含有活性位点的大的细胞外结构域。然而，虽然CD39通常由在分子的两端的两个跨膜结构域锚定到膜，但最近还报道了CD39的可溶性催化活性形式可以在人体循环和小鼠中找到(Yegutkin等人，(2012)《美国实验生物学会联合会期刊(FASEBJ.)》26(9):3875-3883)。尽管描述了各种抗CD39抗体，但据报道没有抗体能够抑制可溶性细胞外CD39蛋白的ATP酶活性。
技术实现思路
本专利技术人已经获得了抑制可溶性(细胞外结构域)人CD39蛋白的酶(ATP酶活性)活性的抗体。抗体另外结合存在于包含肿瘤细胞的细胞的表面表达的人CD39蛋白上的表位，并且有效抑制细胞膜结合的CD39酶(如在细胞表面表达的CD39)的酶(ATP酶活性)活性。通过中和膜结合和可溶性CD39蛋白两者(溶液中的细胞外结构域蛋白质)，可以有利地使用抗体实现个体中CD39活性的更大中和，从而减少免疫抑制，例如用于治疗癌症和/或传染病。虽然先前已经描述了抑制膜结合的CD39酶的酶(ATP酶活性)活性的其它抗CD39抗体，但那些抗体不抑制不结合细胞膜的可溶性CD39蛋白。因此，在一个实施例中提供了抗原结合结构域或包括此类任选地抗体或抗体片段的蛋白质，其结合并抑制或中和可溶性CD39蛋白(sCD39)的ATP酶活性。在一个实施例中，sCD39蛋白缺乏在膜结合的CD39中发现的两个跨膜结构域(即，在N末端和C末端附近的跨膜结构域)。在一个实施例中，sCD39是在循环中发现的非膜结合的sCD39蛋白，例如在人个体中。在一个实施例中，sCD39包括SEQIDNO:44的氨基酸序列或由其组成(任选地进一步包括C末端标签或另一种非CD39衍生的氨基酸序列)。在一个实施例中，当在溶液中与sCD39一起温育时，蛋白质、抗体或抗体片段抑制sCD39的ATP酶活性，例如，根据在不存在本文公开的细胞的情况下进行的方法或测定(参见例如实例、方法)。在一个实施例中，蛋白质、抗体或抗体片段以可溶性(细胞外结构域蛋白质)和膜结合形式两者特异性结合人CD39蛋白。不希望受理论束缚，一些抗体可以通过抑制膜结合的CD39(memCD39)的结构域运动中和膜结合的CD39，然而不会类似地影响可溶性CD39蛋白(sCD39)的活性。据报道，memCD39作为同源多聚体发生，而sCD39是单体，并且此外memCD39中的跨膜结构域经历动态运动，这是与活性位点的功能关系的基础。因此，与sCD39不同，memCD39可以呈现使抗体介导的中和成为可能的设置。一种可能性是功能性中和需要使用同时结合两种memCD39分子(例如，在memCD39同源多聚体内)的二价抗体。除了用作二价结合物之外，中和sCD39(和memCD39)的活性的本专利技术抗体还可以作为单价结合物有效，无论它们是否靶向除了sCD39之外的memCD39。因此，在一个实施例中，提供了抗原结合蛋白，其单价结合人CD39蛋白(sCD39和/或memCD39)，并且中和其酶(ATP酶)活性。抗原结合蛋白可以任选地指定为结合单个CD39蛋白和/或具有能够结合CD39蛋白的单个抗原结合结构域。在一个实施例中，提供抗体片段，任选地F(ab)片段、单链抗体、scFv、多特异性抗体，其单价结合人CD39蛋白(sCD39和/或memCD39)并且中和其酶(ATP酶)活性。在一个实施例中，单价结合人CD39蛋白的CD39中和抗原结合蛋白是多特异性抗原结合蛋白，例如多特异性抗体、双特异性抗体、三特异性抗体等。在一个实施例中，单价结合人CD39蛋白的CD39中和抗原结合蛋白包括结合CD39(sCD39和/或memCD39)的第一(或单个)抗原结合结构域和结合除了CD39之外的蛋白的第二抗原结合结构域。有利地，在一个实施例中，抗体包括人Fc结构域，其经过修饰以具有降低的或基本上缺乏结合人Fcγ受体，例如人CD16、CD32a、CD32b和CD64中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够结合可溶性细胞外结构域人CD39(NTPDase1)蛋白并抑制其ATP酶活性的抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.16 US 62/471,994;2017.11.15 US 62/586,2201.一种能够结合可溶性细胞外结构域人CD39(NTPDase1)蛋白并抑制其ATP酶活性的抗体。2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体在外源添加的ATP的存在下抑制所述CD39蛋白的所述ATP酶活性，任选地其中外源添加的ATP以20μM的浓度提供。3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体能够在细胞的表面处结合人CD39蛋白并且能够在细胞的表面处抑制所述CD39蛋白的所述ATP酶活性。4.根据权利要求1到3所述的抗体，其中所述化合物或抗体不结合分泌的CD39蛋白同种型L2或L4，和/或其中所述化合物或抗体不结合膜结合的CD39蛋白同种型L1或L3。5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述可溶性细胞外结构域CD39包括SEQIDNO:44或45的氨基酸序列。6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体基本上缺乏与人CD16、CD32a、CD32b和/或CD64多肽的结合。7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括Fc结构域，任选地其中与野生型Fc结构域相比，所述Fc结构域包括氨基酸修饰，所述氨基酸修饰与人Fcγ受体CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64中的一个或多个或全部的结合减少或消除。8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全长抗体或抗体片段。9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够在溶液中使人细胞外结构域CD39蛋白的所述ATP酶活性降低超过50％，任选地超过80％。10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够使CD39表达性细胞的所述细胞外ATP酶活性降低至少80％。11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体的特征在于用于抑制CD39的ATP酶活性的EC50不超过1μg/ml，其中CD39的酶活性的抑制通过以下测定：通过对ATP进行定量来评估Ramos细胞中的ATP酶活性的中和。12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体的特征在于如通过流式细胞术测定的结合于Ramos细胞的EC50不超过2μg/ml、任选地不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml、不超过0.1μg/ml。13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体与包括抗体I-394、I-395、I-396或I-399的重链CDR和轻链CDR或重链可变区和轻链可变区的抗体竞争结合于SEQIDNO:1的CD39多肽。14.一种抗体，其与包括抗体I-394的重链CDR和轻链CDR的抗体竞争结合于SEQIDNO:1的CD39多肽并且在溶液中中和人细胞外结构域CD39多肽的ATP酶活性，其中所述抗体缺乏Fc结构域或包括缺乏与人CD16的结合的人Fc结构域，任选地其中所述Fc结构域包括氨基酸修饰以减少与人CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64的结合，任选地进一步地其中所述Fc结构域在Kabat残基N297处包括N-连接糖基化。15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括HCDR1，所述HCDR1包括氨基酸序列DYNMH(SEQIDNO:8)；HCDR2，所述HCDR2包括氨基酸序列YIVPLNGGSTFNQKFKG(SEQIDNO:9)；HCDR3，所述HCDR3包括氨基酸序列GGTRFAY(SEQIDNO:10)；LCDR1，所述LCDR1包括氨基酸序列RASESVDNFGVSFMY(SEQIDNO:11)；LCDR2区，所述LCDR2区包括氨基酸序列GASNQGS(SEQIDNO:12)；和LCDR3区，所述LCDR3区包括氨基酸序列QQTKEVPYT(SEQIDNO:13)。16.根据权利要求1到14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括HCDR1，所述HCDR1包括氨基酸序列DYNMH(SEQIDNO:16)；HCDR2，所述HCDR2包括氨基酸序列YINPNNGGTTYNQKFKG(SEQIDNO:17)；HCDR3，所述HCDR3包括氨基酸序列GGTRFAS(SEQIDNO:18)；LCDR1，所述LCDR1包括氨基酸序列RASESVDNYGISFMY(SEQIDNO:19)；LCDR2区，所述LCDR2区包括氨基酸序列AASTQGS(SEQIDNO:20)；和LCDR3区，所述LCDR3区包括氨基酸序列QQSKEVPFT(SEQIDNO:21)。17.根据权利要求1到14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括HCDR1，所述HCDR1包括氨基酸序列DTYIN(SEQIDNO:24)；HCDR2，所述HCDR2包括氨基酸序列RIDPANGNTKYDPKFQG(SEQIDNO:25)；HCDR3，所述HCDR3包括氨基酸序列WGYDDEEADYFDS(SEQIDNO:26)；LCDR1，所述LCDR1包括氨基酸序列RASESVDNYGISFMN(SEQIDNO:27)；LCDR2区，所述LCDR2区包括氨基酸序列AASNQGS(SEQIDNO:28)；和LCDR3区，所述LCDR3区包括氨基酸序列HQSKEVPWT(SEQIDNO:29)。18.根据权利要求1到14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括HCDR1，所述HCDR1包括氨基酸序列SFWMN(SEQIDNO:32)；HCDR2，所述HCDR2包括氨基酸序列EIDPSDFYTNSNQRFKG(SEQIDNO:33)；HCDR3，所述HCDR3包括氨基酸序列GDFGWYFDV(SEQIDNO:34)；LCDR1，所述LCDR1包括氨基酸序列SASSSINSNYLH(SEQIDNO:35)；LCDR2区，所述LCDR2区包括氨基酸序列RTSNLAS(SEQIDNO:36)；和LCDR3区，所述LCDR3区包括氨基酸序列QQGSSLPRT(SEQIDNO:37)。19.一种能够结合可溶性人CD39(NTPDase1)蛋白并抑制其ATP酶活性的抗体，其中所述抗体选自由以下组成的组：(a)包括以下的抗体：(i)包括SEQIDNO:6的重链可变区的CDR1、2和3的重链和(ii)包括SEQIDNO:7的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；(b)包括以下的抗体：(i)包括SEQIDNO:14的重链可变区的CDR1、2和3的重链和(ii)包括SEQIDNO:15的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；(c)包括以下的抗体：(i)包括SEQIDNO:22的重链可变区的CDR1、2和3的重链和(ii)包括SEQIDNO:23的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；以及(d)包括以下的抗体：(i)包括SEQIDNO:30的重链可变区的CDR1、2和3的重链和(ii)包括SEQIDNO:31的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链。20.一种特异性地结合由细胞表达的人CD39多肽的分离的抗体，其中所述抗体能够在ATP的存在下增加树突细胞的活化。21.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中当单核细胞源性树突细胞在体外与所述抗体和所述ATP一起温育时，所述抗体能够使此类moDC中的细胞表面活化标志物的表达增加。22.根据权利要求20或21所述的抗体，其中外源添加的ATP以0.125mM、0.25mM或0.5mM提供。23.根据权利要求21或22所述的抗体，其中细胞表面活化标志物的表达的增加通过以下进行评估：在ATP的存在下温育moDC，持续24小时并且通过流式细胞术分析CD80、CD83和/或HLA-DR在moDC上的细胞表面表达。24.根据权利要求21到23所述的抗体，其中与阴性对照(例如，培养基)相比，细胞表面标志物的表达的所述增加为至少40％、50％、75％或80％。25.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中当T细胞在ATP的存在下与CD39表达性DC细胞体外共培养时，所述抗体能够增加T细胞增殖。26.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中在每种情况下，相对于所述抗体与包括S...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·尚特克斯，N·戈尔丁，C·帕图雷，I·佩罗特，B·罗西，
申请(专利权)人：先天制药公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR