用于治疗衰老细胞的蛋白治疗剂制造技术

本发明专利技术公开了产生条件活性蛋白的方法，该蛋白靶向衰老细胞并且在衰老细胞的细胞外环境中具有条件活性。该方法包括使用演变的蛋白的文库的发现方法和使用生理浓度的体液组分的测试。本发明专利技术还公开了用于杀死或去除衰老细胞的条件活性蛋白，使用这些条件活性蛋白的药物组合物和使用该药物组合物治疗与年龄相关的疾病、病症或障碍的方法。条件活性蛋白可以进一步演变，与其他分子缀合，被掩蔽，通过连接可切割部分而降低活性。

Protein therapeutics for the treatment of aging cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗衰老细胞的蛋白治疗剂
本专利技术涉及治疗或清除衰老细胞和/或治疗与衰老细胞相关的疾病或病症的领域。特别地，本专利技术涉及靶向衰老细胞的条件活性蛋白和产生这种条件活性蛋白的方法。
技术介绍
衰老细胞具有代谢活性，但停滞在细胞生长周期的G1期，其寿命由多个显性基因控制(Stanulis-Praeger,Mech.AgeingDev.,vol.38,pp.1-48,1987)。衰老细胞在几个重要方面不同于静止期细胞和终末分化的细胞，其具有特征性形态变化，例如变大、变扁平和颗粒度增加(Dimrietal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.92,pp.9363-9367,1995)。即使被有丝分裂原刺激，衰老细胞也不会分裂(Campisi,TrendsCellBiol.,vol.11,pp.S27-S31,2001)。衰老涉及p53和/或Rb及其调节剂如p16INK4a、p21和ARF的活化。除非p53或Rb失活，否则衰老通常是不可逆的。衰老细胞表达增加的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)水平并且在pH6下表现出β-半乳糖苷酶活性的染色(Sharplessetal.,J.Clin.Invest.,vol.113,pp.160-168,2004)。不可逆的G1停滞是通过使Rb磷酸化的细白胞周期蛋依赖性激酶(CdK)复合物失活来介导的。P21在衰老细胞中积累，抑制CdK4-CdK6。P16也抑制CdK4-CdK6并在衰老细胞中以与β-半乳糖苷酶活性和细胞体积成比例方式积累(Steinetal.,Mol.Cell.Biol.,vol.19,pp.2109-2117,1999)。有证据表明p21在衰老开始时表达，但不是维持衰老所必需的，而p16表达一旦开始就有助于维持衰老。由于在某些情况下，衰老与每个细胞分裂时端粒的逐渐缩短有关，当某些染色体端粒达到临界长度时就会触发衰老(MathonandLloyd,Nat.Rev.Cancer,vol.3,pp.203-213,2001；Martins,U.M.ExpCellRes.,vol.256,pp.291-299,2000)。通过延长端粒的端粒酶的表达可以消除衰老。例如，当成纤维细胞被转染以表达端粒酶时，人成纤维细胞无限地进行复制。大多数癌细胞表达端粒酶以维持端粒长度并无限地复制。不表达端粒酶的少数癌细胞具有端粒延长替代机制(ALT)。还存在衰老的其他原因。总的来说，这些其他原因通常被称为应激诱导的早衰(SIPS)。氧化应激可缩短端粒，从而诱导衰老(vonZglinicki,TrendsBiochem.Sci.,vol.27,pp.339-344,2002)。已证明高氧(hyperoxia)可诱导衰老。在G1期早期至中期γ射线照射人成纤维细胞以p53依赖性方式引起衰老(DiLeonardoetal.,GenesDev.,vol.8,pp.2540-2551,1994)。紫外线辐射也会引起衰老。可以诱导衰老的其他试剂包括过氧化氢(Krtolicaetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.98,pp.12072-12077,2001)、丁酸钠、5-氮杂胞苷，以及用Ras癌基因转染(Tominaga,Mech.AgeingDev.,vol.123,pp.927-936,2002)。已证明化学治疗剂(包括多柔比星、顺铂和许多其它化合物)在癌细胞中诱导衰老(Roninson,CancerRes.,vol.63,pp.2705-2715,2003)。5-溴脱氧尿苷治疗会导致正常细胞和恶性细胞的衰老(Michishitaetal.,J.Biochem.,vol.126,pp.1052-1059,1999)。一般而言，破坏DNA的药剂能够导致衰老。证据表明衰老(senescence)与老化(aging)之间存在关系。与来自年轻供体的细胞相比，来自年老供体的培养细胞在较少的生长周期后表现出衰老(Martinetal.,Lab.Invest.,vol.23,pp.86-92,1970；Schneideretal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.73,pp.3584-3588,1976)。与来自长寿物种的细胞相比，来自短寿命物种的细胞在较少的生长周期后开始衰老(Rohme,D.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.78,pp.5009-3320,1981)。与来自年龄匹配的对照组的细胞相比，来自具有遗传性早衰综合征(例如Werner综合征)的供体的培养细胞在较少的生长周期后表现出衰老。衰老赋予衰老细胞功能性变化，所述衰老细胞与各种与年龄相关的疾病和病症有关(Changetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.97,pp.4291-4296,2000)。随着年龄的增长，衰老细胞在个体的组织和器官中积累，并在与年龄相关的病理部位处被发现。鉴于衰老细胞和与年龄相关的健康下降的某些方面存在因果关系，并且衰老细胞可能导致某些疾病，并且由于必要的维持生命的化学治疗和放射治疗会诱导衰老细胞，因此衰老细胞的存在可能对全世界数百万患者产生有害影响。人们普遍认为，选择性消除衰老细胞可预防和治疗与年龄相关的疾病和病症。衰老细胞也会促进肿瘤发生。衰老的基质细胞表达肿瘤促进因子，其对邻近的上皮细胞产生旁分泌作用。这些作用包括促有丝分裂和抗细胞凋亡(Changetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.97,pp.4291-4296,2000)。已证明衰老的成纤维细胞刺激癌前和恶性上皮细胞，但不刺激正常上皮细胞在小鼠体内形成肿瘤。当少至10％的成纤维细胞衰老时发生这种情况(Krtolicaetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.98,pp.12072-12077,2001)。衰老细胞分泌的肿瘤促进因子部分由p21waf1/cip1/sdi1介导(Roninson,CancerRes.,vol.63,pp.2705-2715,2003)。衰老的基质细胞的阈值似乎提供了允许相邻的癌前上皮细胞存活、迁移和分裂的环境(Campisi,Nat.Rev.Cancer,vol.3,pp.339-349,2003)。因此，靶向衰老细胞的疗法是衰老相关的疾病和病症的有希望的治疗选择。US2016/0038576公开了一种用于诱导特异性针对衰老细胞的适应性免疫应答的免疫原性组合物，用于治疗和预防与年龄相关的疾病和病症，以及与衰老细胞的存在相关或因衰老细胞的存在而加重的其他疾病和病症。免疫原性组合物包括衰老细胞相关的抗原、编码衰老细胞相关的抗原的多核苷酸和用于给予个体的包含该多核苷酸的重组表达载体中的至少一种或多种。WO2015116740公开了一种施用治疗有效量的小分子衰老细胞溶解剂(senolyticagent)的方法，所述小分子衰老细胞溶解剂选择性地杀死衰老细胞而不会杀死非衰老细胞，用于治疗衰老细胞相关的疾病和病症。可通过该方法治疗的衰老细胞相关的疾病和病症包括与动脉硬化相关或由动脉硬化引起的心血管疾病和病症，例如动脉粥样硬化、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、骨关节炎、衰老相关的眼本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由结合与衰老细胞相关的靶标的亲本蛋白制备结合所述与衰老细胞相关的靶标的条件活性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(i)使用一种或多种演变技术来演变编码所述亲本蛋白的DNA以产生突变DNA；(ii)表达所述突变DNA以获得突变蛋白；(iii)使所述突变蛋白在所述衰老细胞的细胞外条件下进行测试，并在正常生理条件下进行测试；和(iv)从所述突变蛋白中选择表现出以下至少一种特性的条件活性蛋白：(a)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的相同活性相比增加；和(b)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.03 US 62/441,745;2017.05.23 US 62/509,8301.一种由结合与衰老细胞相关的靶标的亲本蛋白制备结合所述与衰老细胞相关的靶标的条件活性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(i)使用一种或多种演变技术来演变编码所述亲本蛋白的DNA以产生突变DNA；(ii)表达所述突变DNA以获得突变蛋白；(iii)使所述突变蛋白在所述衰老细胞的细胞外条件下进行测试，并在正常生理条件下进行测试；和(iv)从所述突变蛋白中选择表现出以下至少一种特性的条件活性蛋白：(a)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的相同活性相比增加；和(b)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比增加。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲本蛋白选自酶、抗体、受体、配体、酶的片段、抗体的片段、受体的片段和配体的片段。3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述活性是对所述靶标的结合活性。4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述亲本蛋白是酶，并且所述活性是使用所述衰老细胞的至少一部分作为底物的酶活性。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶标是位于衰老细胞外表面上的表面分子。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述表面分子是所述衰老细胞的细胞膜蛋白。7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶标为选自APC、ARHGAP1、ARMCX-3、AXL、B2MG、BCL2L1、CAPNS2、CD261、CD39、CD54、CD73、CD95、CDC42、CDKN2C、CLYBL、COPG1、CRKL、DCR1、DCR2、DCR3、DEP1、DGKA、EBP、EBP50、FASL、FGF1、GBA3、GIT2、ICAM1、ICAM3、IGF1、ISG20、ITGAV、KITLG、LaminB1、LANCL1、LCMT2、LPHN1、MADCAM1、MAG、MAP3K14、MAPK、MEF2C、miR22、MMP3、MTHFD2、NAIP、NAPG、NCKAP1、连接素4、NNMT、NOTCH3、NTAL、OPG、OSBPL3、p16、p16INK4a、p19、p21、p53、PAI1、PARK2、PFN1、PGM、PLD3、PMS2、POU5F1、PPP1A、PPP1CB、PRKRA、PRPF19、PRTG、RAC1、RAPGEF1、RET、Smurf2、STX4、VAMP3、VIT、VPS26A、WEE1、YAP1、YH2AX和YWHAE中的至少一种。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述条件活性蛋白是环状肽。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述环状肽的长度为约5至约500个氨基酸，约8至约300个氨基酸，约8至约200个氨基酸，约10至约100个个氨基酸，或约10至约50个氨基酸。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述条件活性蛋白的所述活性，与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的所述活性的比为至少约1.3:1，或至少约2:1，或至少约3:1，或至少约4:1，或至少约5:1，或至少约6:1，或至少约7:1，或至少约8:1，或至少约9:1，或至少约10:1，或至少约11:1，或至少约12:1，或至少约13:1，或至少约14:1，或至少约15:1，或至少约16:1，或至少约17:1，或至少约18:1，或至少约19:1，或至少约20:1，或至少约30:1，或至少约40:1，或至少约50:1，或至少约60:1，或至少约70:1，或至少约80:1，或至少约90:1，或至少约100:1。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是pH范围为约5.5至约7.0，或约6.0至约7.0，或约6.2至约6.8。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述正常生理条件是pH范围为约7.2至约7.8，或约7.2至约7.6，或约7.4至约7.6。13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是脱氧核苷酸的浓度低于相同脱氧核苷酸的正常生理浓度。14.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是氧的浓度低于氧的正常生理浓度。15.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是NAD+/NADH的比低于NAD+/NADH的正常生理比。16.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是选自亚牛磺酸、半胱氨酸亚磺酸、半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、γ-谷氨酰基丙氨酸、γ-谷氨酰基蛋氨酸、pyridoxate、γ-谷氨酰基谷氨酰胺和丙氨酸的至少一种的氧化还原内稳态代谢物的浓度，其相对于相同氧化还原内稳态代谢物的正常生理浓度增加。17.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是选自3-脲基丙酸盐、尿酸、7-甲基鸟嘌呤和次黄嘌呤的至少一种的核苷酸代谢物的浓度，其相对于相同核苷酸代谢物的正常生理浓度增加。18.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是胸苷的浓度相对于胸苷的正常生理浓度降低。19.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是选自甘氨酰异亮氨酸、甘氨酰缬氨酸、甘氨酰亮氨酸、异亮氨酰甘氨酸和缬氨酰甘氨酸的至少一种二肽的浓度，其相对于同种二肽的正常生理浓度降低。20.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是选自亚油酸、二高-亚油酸和10-十七碳烯酸的至少一种的脂肪酸的浓度，其相对于所述脂肪酸的正常生理浓度降低。21.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是选自2-羟基棕榈酸、2-羟基硬脂酸、3-羟基癸酸、3-羟基辛酸和甘油磷酸胆碱的至少一种磷脂代谢物的浓度，其相对于所述磷脂代谢物的正常生理浓度增加。22.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是选自丙氨酸、C-糖基色氨酸、犬尿氨酸、二甲基精氨酸和鸟氨酸的至少一种氨基酸代谢物的浓度，其相对于所述氨基酸代谢物的正常生理浓度增加。23.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是苯丙酮酸的浓度相对于所述苯丙酮酸的正常生理浓度降低。24.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是选自富马酸、丙二酸、二十碳五烯酸和柠檬酸的至少一种代谢物的浓度，其相对于所述代谢物的正常生理浓度增加。25.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的比，其相对于甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的正常生理比增加。26.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是所述衰老细胞分泌的蛋白的浓度，其与所述蛋白的正常生理浓度相比增加，其中所述衰老细胞分泌的所述蛋白为选自GM-CSF、GROa、GRC-α、GRC-β、GRC-γ、IGFBP-7、IL-1α、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、MCP-2、MIP-1a、MMP-1、MMP-10、MMP-3、双调蛋白、ENA-78、嗜酸细胞活化趋化因子-3、GCP-2、GITR、HGF、ICAM-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、IL-13、IL-Iβ、MCP-4、MIF、MIP-3a、MMP-12、MMP-13、MMP-14、NAP2、制瘤素M、骨保护素、PIGF、RANTES、sgp130、TIMP-2、TRAIL-R3、Acrp30、血管生成素、Axl、bFGF、BLC、BTC、CTACK、EGF-R、Fas、FGF-7、G-CSF、GDNF、HCC-4、I-309、IFN-γ、IGFBP-1、IL-1R1、IL-11、IL-15、IL-2R-a、IL-6R、I-TAC、瘦蛋白、LIF、MMP-2、MSP-a、PAI-1、PAI-2、PDGF-BB、SCF、SDF-1、sTNFRI、sTNFRII、血小板生成素、TIMP-1、tPA、uPA、uPAR、VEGF、MCP-3、IGF-1、TGF-β3、MIP-1-δ、IL-4、IL-16、BMP-4、MDC、IL-10、Fit-3配体、ICAM-1、CNTF、EGF和BMP-6中的至少一种。27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中在所述正常生理条件下的测试和在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试在含有选自无机化合物、离子和有机分子的至少一种组分的测试溶液中进行。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述至少一种组分在用于所述正常生理条件下的测试和用于所述衰老细胞的细胞外条件下的测试的测试溶液中具有基本相同的浓度。29.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述至少一种组分是无机化合物，并且选自硼酸、氯化钙、硝酸钙、磷酸二铵、硫酸镁、磷酸一铵、磷酸一钾、氯化钾、硫酸钾、硫酸铜、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、硝酸钙、钙螯合物、铜螯合物、铁螯合物、铁螯合物、锰螯合物、锌螯合物、钼酸铵、硫酸铵、碳酸钙、磷酸镁、碳酸氢钾、硝酸钾、盐酸、二氧化碳、硫酸、磷酸、碳酸、尿酸、氯化氢和尿素。30.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述至少一种组分是离子，并且选自磷离子、硫离子、氯离子、镁离子、钠离子、钾离子、铵离子、铁离子、锌离子和铜离子。31.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述至少一种组分为选自浓度范围为2-7.0mg/dL的尿酸、浓度范围为8.2-11.6mg/dL的钙离子、浓度范围为355-381mg/dL的氯离子、浓度范围为0.028-0.210mg/dL的铁离子、浓度范围为12.1-25.4mg/dL的钾离子、浓度范围为300-330mg/dL的钠离子和浓度范围为15-30mM的碳酸中的一种或多种。32.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述至少一种组分是有机分子，并且是选自组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、吡咯赖氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸和酪氨酸的氨基酸。33.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述至少一种组分是有机分子，并且是选自柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酰乙酸、β-羟基丁酸、乳酸、丙酮酸、α-酮酸、乙酸和挥发性脂肪酸的有机酸。34.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述至少一种组分是有机分子，并且是选自葡萄糖、戊糖、己糖、木糖、核糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、GlcNAcβ1-3Gal、Galα1-4Gal、Manα1-2Man、GalNAcβ1-3Gal和O-糖苷、N-糖苷、C-糖苷和S-糖苷的糖。35.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述至少一种组分是离子并且选自镁离子、硫酸根离子、硫酸氢根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离离子、过硫酸根离子、单过硫酸根子、硼酸根离子和铵离子。36.根据权利要求1所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是在约5.5至约7.0范围内的第一pH，所述正常生理条件是在约7.2至约7.8范围内的第二pH，并且在含有至少一种分子量小于900a.m.u且pKa与所述第一pH相差至多0.5、1、2、3或4个pH单位的物质的测试溶液中进行所述一种或多种测试。37.根据权利要求1所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是在约5.5至约7.0范围内的第一pH，所述正常生理条件是在约7.2至约7.8范围内的第二pH，在含有至少一种分子量小于900a.m.u的物质的测试溶液中进行所述一种或多种测试，并且所述物质具有在所述第一pH和所述第二pH之间的pKa。38.根据权利要求1所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外条件是在约5.5至约7.0范围内的第一pH，所述正常生理条件是在约7.2至约7.8范围内的第二pH，并且在含有选自组氨酸、组胺、氢化腺苷二磷酸、氢化腺苷三磷酸、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、二硫化物、硫化氢、铵和磷酸二氢盐的至少一种物质的测试溶液中进行所述一种或多种测试。39.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择步骤(iv)包括选择...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰·M·肖特，
申请(专利权)人：生物蛋白有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US