一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法，属于生物技术领域。本发明专利技术提供的检测方法包括以下步骤：首先，利用核酸提取试剂提取待测样品的DNA，得到DNA提取液；接着，将DNA提取液、复溶液、甜菜碱和引物组进行混合，得到反应液；然后，将反应液进行PCR扩增反应，便可根据PCR扩增反应结果判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌。其中，该引物组包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环状引物和下游环状引物。另外，本发明专利技术提供的LAMP引物组具有良好的特异性，使用该引物组可以快速有效地检测出痰液中的铜绿假单胞菌，而且操作简单、方便。

A primer group, kit and method for the detection of Pseudomonas aeruginosa

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及生物
，具体是一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，是呼吸道感染的常见细菌，其分布十分广泛，在免疫功能受损的病人中能够引起严重感染。环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，其具有检测周期短、灵敏度高、设备简单以及产物检测便捷等优点。然而，由于现有LAMP引物组的特异性较差，目前主要是通过LAMP技术来检测食品中的铜绿假单胞菌，其不易对痰液等其他样品中的铜绿假单胞菌进行检测，因此存在着一定的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组，包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环状引物和下游环状引物；所述上游外部引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示：CGGSGCWGTCSAGAAC；所述下游外部引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示：TGSCGGAAAWGCCGWAAG；所述上游内部引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示：ACCSTCGATACGSTTTCCCGTWGTGAGGWGTSCGWGTGGTT；所述下游内部引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:4所示：TCSAATCCCTCSCTCACCGSGGTGCSGAAATGWAAAWGGC；所述上游环状引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:5所示：TCSAGSCGTGCWCCTTC；所述下游环状引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:6所示：AWGGCCSGGCTWATCWAGTT；其中，上述核苷酸序列中的W代表A或T，S代表G或C。本专利技术实施例还提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其包括核酸提取试剂、复溶液、甜菜碱以及引物组混合物，所述的引物组混合物包括上述引物组中的各个引物。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述的引物组混合物包括以下按照体积份计的组分：上游外部引物4-6份、下游外部引物4-6份、上游内部引物3-5份、下游内部引物3-5份、上游环状引物18-22份、下游环状引物18-22份。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述的引物组中，上游外部引物和下游外部引物的摩尔浓度均为4-6pmol/μL。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述的引物组中，上游内部引物和下游内部引物的摩尔浓度均为30-50pmol/μL。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述的引物组中，上游环状引物和下游环状引物的摩尔浓度均为10-30pmol/μL。本专利技术实施例提供的一种优选方案，所述甜菜碱的摩尔浓度为4-6mol/L。本专利技术实施例还提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的方法，该方法是采用上述试剂盒进行检测，其包括以下步骤：(1)利用核酸提取试剂提取待测样品的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid，DNA)，得到DNA提取液；(2)将DNA提取液、复溶液、甜菜碱和引物组混合物进行混合，得到反应液；(3)将反应液进行聚合酶链式(PolymeraseChainReaction，PCR)扩增反应，根据PCR扩增反应结果判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(3)中，PCR扩增反应的温度为60-65℃。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(3)中，根据PCR扩增反应结果的CT值判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌；若CT值不大于55，则待测样品中含有铜绿假单胞菌；若CT值大于55，则待测样品中不含有铜绿假单胞菌。与现有技术相比，本专利技术实施例的有益效果是：本专利技术实施例提供的LAMP引物组具有良好的特异性，使用该引物组可以快速有效地检测出痰液中的铜绿假单胞菌，而且操作简单、方便。附图说明图1为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(A/B)。图2为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(A/C)。图3为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(A/D)。图4为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(A/E)。图5为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(A/F)。图6为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(A/G)。图7为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(A/H)。图8为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(A/B)。图9为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(A/C)。图10为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(A/D)。图11为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(A/E)。图12为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(A/F)。图13为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(A/G)。图14为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(A/H)。图15为实施例6得到的实时荧光扩增曲线。图16为实施例7得到的实时荧光扩增曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。实施例1该实施例提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组以及含有该引物组的试剂盒，具体的，该引物组是采用PrimerExplorerV5设计的LAMP引物组，其包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环状引物和下游环状引物；其中，所述上游外部引物的核苷酸序列为：CGGCGCTGTCCAGAAC；所述下游外部引物的核苷酸序列为：TGCCGGAAATGCCGTAAG；所述上游内部引物的核苷酸序列为：ACCCTCGATACGCTTTCCCGTTGTGAGGTGTCCGTGTGGTT；所述下游内部引物的核苷酸序列为：TCCAATCCCTCCCTCACCGCGGTGCCGAAATGTAAATGGC；所述上游环状引物的核苷酸序列为：TCCAGCCGTGCTCCTTC；所述下游环状引物的核苷酸序列为：ATGGCCCGGCTTATCTAGTT。另外，该试剂盒包括核酸提取试剂、复溶液、4mol/L的甜菜碱以及引物组混合物，其中，引物组混合物包括以下组分：上游外部引物4μL、下游外部引物4μL、上游内部引物3μL、下游内部引物3μL、上游环状引物18μL、下游环状引物18μL。另外，上游外部引物和下游外部引物的摩尔浓度均为4pmol/μL；上游内部引物和下游内部引物的摩尔浓度均为30pmol/μL；上游环状引物和下游环状引物的摩尔浓度均为10pmol/μL；核酸提取试剂可以根据不同待测样品进行选择，譬如可以选用广州华峰生物科技有限公司的“铜绿假单孢菌核酸检测试剂盒”中的核酸提取试剂，复溶液可选用广州华峰生物科技有限公司市售的产品。实施例2该实施例提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组以及含有该引物组的试剂盒，具体的，该引物组是采用PrimerExplorerV5设计的LAMP引物组，其包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组，其特征在于，所述的引物组包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环状引物和下游环状引物；所述上游外部引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示，所述下游外部引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示，所述上游内部引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示，所述下游内部引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示，所述上游环状引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:5所示，所述下游环状引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:6所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组，其特征在于，所述的引物组包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环状引物和下游环状引物；所述上游外部引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:1所示，所述下游外部引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:2所示，所述上游内部引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:3所示，所述下游内部引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:4所示，所述上游环状引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:5所示，所述下游环状引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:6所示。2.一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，包括核酸提取试剂、复溶液和甜菜碱，其特征在于，所述的试剂盒还包括引物组混合物，所述的引物组混合物包括如权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于，所述的引物组混合物包括以下按照体积份计的组分：上游外部引物4-6份、下游外部引物4-6份、上游内部引物3-5份、下游内部引物3-5份、上游环状引物18-22份、下游环状引物18-22份。4.根据权利要求3所述的一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于，所述的引物组中，上游外部引物和下游外部引物的摩尔浓度均为4-6pmol/μL。5.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘静姿，齐财，黄培，周庭波，韩克兵，王磊，
申请(专利权)人：贵州金玖生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州,52