一种基于微流控芯片的灿烂弧菌等温扩增快速检测的引物及其方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片的灿烂弧菌等温扩增快速检测的引物及其方法，属于微生物检测技术领域。本发明专利技术采用含有3对引物的环介导等温扩增(LAMP)体系和反应池阵列微流控芯片检测方法，经LAMP引物设计和筛选，最终确定针对灿烂弧菌抗砷基因arsB中的特定区域设计的3对引物，具体序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6所示。使用本发明专利技术进行基于微流控芯片的灿烂弧菌等温扩增检测，具有更高的扩增效率和特异性，操作过程简便、快捷，结果稳定、可靠，可以更好的用于灿烂弧菌的早期快速检测和及时防治，具有较好的应用前景。

A Primer and Method for Rapid Isothermal Amplification Detection of Vibrio brilliant Based on Microfluidic Chip

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控芯片的灿烂弧菌等温扩增快速检测的引物及其方法
本专利技术涉及一种基于微流控芯片的灿烂弧菌等温扩增快速检测的引物及其方法，属于微生物检测

技术介绍
“腐皮综合症”作为最常见的刺参流行病之一，具有传染性强、传播范围广的特点，大量的病原菌在受机械损伤的刺参暴露处繁殖产生胞外产物，并消化其他正常组织，最终触发刺参自溶机制，引起刺参死亡，其致死率高达90％以上，对海水养殖有很严重的危害。建立快速、准确的检测技术，实现病原菌的早期诊断和基层的即时检测，对于刺参腐皮综合症监控和有效预防具有重要意义。灿烂弧菌(VibrioSplendidus)属于革兰氏阴性细菌，被认为是刺参腐皮综合症的主要病原。目前，灿烂弧菌检测方法主要有三种，传统的细菌分离培养和生化鉴定操作复杂、检测周期长，不适合快速检测；免疫学方法灵敏度较低，易出现假阳性结果；常规PCR方法涉及繁琐的样品处理过程且无法摆脱对昂贵仪器和专业人员的依赖，不适用于基层。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术是2000年由日本科学家Notomi开发，它针对靶基因上的6～8个不同区域设计4～6条特异性引物，利用高活性的链置换DNA聚合酶在恒温条件(60～65℃)下反应30～60分钟即可完成扩增，其对模板纯度和温控装置要求较低，具有简便、快速、灵敏、特异、低成本等优点，已广泛应用于病原体现场快速检测。根据文献调研的结果，关于灿烂弧菌LAMP检测方面的工作报道较少，且前期验证结果表明，已有的灿烂弧菌LAMP检测体系的扩增效率、检测特异性和重复性均难以满足应用需求，且整个检测流程涉及多步分离的操作过程，存在污染的风险和受人为影响的可能，在一定程度上限制了该方法的应用和推广。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是构建高效、特异的灿烂弧菌等温扩增体系和快速、可靠的检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于微流控芯片的灿烂弧菌等温扩增快速检测引物，首次构建了含有3对引物的灿烂弧菌环介导等温扩增(LAMP)体系，并首次将微流控技术用于灿烂弧菌等温扩增检测，引物序列如SEQIDNO.1/SEQIDNO.2；SEQIDNO.3/SEQIDNO.4；SEQIDNO.5/SEQIDNO.6所示。本专利技术还提供了一种基于微流控芯片进行灿烂弧菌的等温扩增快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)微流控芯片准备芯片使用前，预先将引物SEQIDNO.1/SEQIDNO.2；SEQIDNO.3/SEQIDNO.4；SEQIDNO.5/SEQIDNO.6固定在芯片的反应池中，并将芯片密封保存、备用，所述SEQIDNO.1/SEQIDNO.2的浓度为0.2μM；SEQIDNO.3/SEQIDNO.4的浓度为1.6μM；SEQIDNO.5/SEQIDNO.6的浓度为0.8μM；(2)芯片上DNA模板制备待测细菌纯培养物经离心、清洗后，从芯片加液孔加入，经过加液通道和分液通道进入各反应池中，随后从加液孔加入矿物油以隔离各反应池并完全覆盖细菌溶液；加热芯片煮沸菌液，再降至室温平衡，得到DNA模板。(3)芯片反应池中LAMP反应液注入将1×LAMP反应液从芯片的加液孔加入，经分液通道进入各反应池中，随后加入矿物油隔离各反应池并覆盖反应液。(4)芯片LAMP反应及检测将步骤(3)得到的芯片固定在加热板上，在60～65℃下反应30～60min，随后在80℃下8～10min以终止反应，对结果进行检测和分析。进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中所述的微流控芯片以2×2阵列、2×4阵列、2×8阵列、4×4阵列、4×8阵列的反应池为一组，所述反应池中心间距均为6～12mm；所述每组反应池阵列含有一个加液孔、一个加液通道和至少4个分液通道，所述反应池通过连接通道与加液孔相连，且各个反应池的连接通道位置对称、长度相等。进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中所述的微流控芯片的材料包括硅片、玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PSt)、聚碳酸酯(PC)。进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中所述的将引物固定到芯片的反应池中的方法为将引物溶液在室温下晾干或在45℃下10～15min烘干。进一步地，上述技术方案中，步骤(2)中所述的煮沸时间为6～10min。进一步地，上述技术方案中，步骤(3)中所述的1×LAMP反应液包括0.16～0.32U/μL的大片段BStDNA聚合酶及其1×缓冲液、1.4mM的dNTP、6～12mM的MgSO4和0.8～1.6M的甜菜碱。进一步地，上述技术方案中，步骤(3)中所述的LAMP反应液的体积与步骤(2)中所述的待测细菌溶液的体积比为≥2.5:1。进一步地，上述技术方案中，步骤(4)中所述的加热板为恒温控制板或实时荧光PCR仪的96孔加热板。进一步地，上述技术方案中，步骤(4)中所述的检测和分析方法为浊度观察、显色观测、实时荧光扩增曲线分析。浊度观察：将反应后的样品池与阴性对照池进行比较，若出现明显的白色絮状浑浊，证明所测样品为灿烂弧菌，反之亦然。显色观测：反应体系中预先加入显色试剂(如羟基萘酚蓝，HNB)，观测反应前后样品池的颜色变化，若从紫色变为蓝色，证明所测样品为灿烂弧菌，反之亦然。实时荧光扩增曲线分析：芯片反应池中心间距为9mm时，采用带有96孔加热板的实时荧光PCR仪进行芯片LAMP反应和实时荧光检测，若样品扩增曲线有明显信号且能与阴性对照曲线明显区分，证明所测样品为灿烂弧菌，反之亦然。与现有方法相比，本专利技术的优点在于：1)LAMP检测体系高效、特异：本专利技术采用的LAMP引物除包含2对基本的引物外(SEQIDNO.1/SEQIDNO.2；SEQIDNO.3/SEQIDNO.4)，还包括1对环引物(SEQIDNO.5/SEQIDNO.6)，可进一步识别目的基因的另外2个特异性序列，并提供更多的扩增位点，有效提高了LAMP等温扩增的效率和特异性；2)操作简便、快捷：引物可预先固定在芯片反应池中，通用反应混合液可预先配制，整个检测操作只包括从加样孔加入菌液制备模板、再加入通用反应混合液两步，各个反应池的分液过程由分液通道自动实现，极大地简化了操作过程；3)结果稳定、可靠：芯片结构设计确保分液过程均匀、重复，避免人为干扰；反应池采用矿物油封闭，防止污染和溶液蒸发；每组阵列中的多个反应池可设置阳性对照、阴性对照、单个指标重复或多个指标(通过在反应池中预先固定不同的引物，或以水作为空白对照)，从而确保检测结果的可靠性。综上所述，使用本专利技术进行基于微流控芯片的灿烂弧菌等温扩增检测，具有更高的扩增效率和特异性，操作简便、快捷，结果稳定、可靠，可以更好的用于灿烂弧菌的早期快速检测和及时防治。附图说明图1为灿烂弧菌LAMP引物arsB特异性检测结果。图2为灿烂弧菌LAMP引物arsB重复性检测结果；图3为四反应池阵列(2×2)微流控芯片设计图。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细的描述。实施例1灿烂弧菌LAMP引物arsB特异性检测1、LAMP引物设计及筛选选择灿烂弧菌目标基因的保守区序列进行LAMP引物设计，根据LAMP引物设计原则和参数优化以及扩增效果进行筛选，最终确定针对灿烂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微流控芯片的灿烂弧菌等温扩增快速检测引物，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的灿烂弧菌等温扩增快速检测引物，其特征在于，引物序列如SEQIDNO.1/SEQIDNO.2；SEQIDNO.3/SEQIDNO.4；SEQIDNO.5/SEQIDNO.6所示。2.根据权利要求1所述的引物利用微流控芯片进行灿烂弧菌的等温扩增快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)微流控芯片准备芯片使用前，预先将引物SEQIDNO.1/SEQIDNO.2；SEQIDNO.3/SEQIDNO.4；SEQIDNO.5/SEQIDNO.6固定在芯片的反应池中，并将芯片密封保存、备用，所述SEQIDNO.1/SEQIDNO.2的浓度为0.2μM；SEQIDNO.3/SEQIDNO.4的浓度为1.6μM；SEQIDNO.5/SEQIDNO.6的浓度为0.8μM；(2)芯片上DNA模板制备待测细菌纯培养物经离心、清洗后，从芯片加液孔加入，经过加液通道和分液通道进入各反应池中，随后从加液孔加入矿物油以隔离各反应池并完全覆盖细菌溶液；加热芯片煮沸菌液，再降至室温，得到DNA模板；(3)芯片反应池中LAMP反应液注入将1×LAMP反应液从芯片的加液孔加入，经分液通道进入各反应池中，随后加入矿物油隔离各反应池并覆盖反应液。(4)芯片LAMP反应及检测将步骤(3)得到的芯片固定在加热板上，在60～65℃下反应30～60min，随后在80℃下8～10min以终止反应，对结果进行检测和分析。3.根据权利要求2所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟润涛，刘士林，王梦雨，巩宁，孙野青，
申请(专利权)人：大连海事大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21