本发明专利技术公开了一种环介导等温扩增法检测枯草芽孢杆菌的引物，是以枯草芽孢杆菌的gyrA基因和gyrB基因为靶序列设计获得，其中所述引物包括一组外引物F3/B3、一组内引物FIP/BIP及一组环引物LF/LB。本发明专利技术还公开了所述引物在检测枯草芽孢杆菌中的应用。实验证实本发明专利技术的3组LAMP引物具有很强的特异性，灵敏性在对比试验中显示至少高出现有方法一个数量级。本发明专利技术的检测过程只需在恒温水浴条件下进行，不需要昂贵的变温仪器，结果可以通过肉眼或加入简单的指示试剂便可判断，反应时间不到40分钟，检测周期更短，实验成本更低。
A Ring-mediated Isothermal Amplification Primer for Detection of Bacillus subtilis and Its Application
【技术实现步骤摘要】
一种环介导等温扩增法检测枯草芽孢杆菌的引物及其应用
本专利技术属于微生物肥料中关于枯草芽孢杆菌检测或鉴定
，涉及一种利用环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术快速检测枯草芽孢杆菌的引物及其应用。
技术介绍
目前对于细菌的检测方法主要有细菌分离培养鉴定方法、免疫学检测方法和分子生物学方法。细菌分离培养鉴定方法是应用液体培养基、半固体培养基或固体培养基将分离得到的细菌进行培养，并通过生理生化及染色镜检对微生物进行诊断。该鉴定方法的缺点是试验周期很长，一般微生物分离培养需要2天，鉴定所需要的时间在一周左右。因此，此类方法不能够适应目前快速、准确的诊断市场需求。免疫学检测方法的原理是根据抗原-抗体结合形成沉淀的复合物，是基于抗原与抗体特异性结合的原理进行检测的一种血清学方法。该方法的缺点是检测过程中需要的试剂非常昂贵，同时根据不同的目标微生物，特异性也不同，容易出现假阳性。分子生物学是在分子水平上研究生命现象物质基础的学科。常见的应用于检测微生物方法有核酸凝胶电泳实验、核酸分子杂交实验、核酸体外扩增实验等方法。该方法的缺点在于，需要昂贵的变温反应设备和检测仪器。对于基层的投放使用难以做到全覆盖。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），是芽孢杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，因此得名枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌作为一种有益的细菌，本身具有对环境友好、对粮食作物安全、对人畜无害等优点而受到了人们的普遍关注和深入研究。枯草芽孢杆菌具有发达的分泌系统和较强的环境适应性，在农业、水产养殖、人体益生菌等领域广泛应用。枯草芽孢杆菌对多种病原菌都具有拮抗性能，在农业生产中可用于防治多种植物病害，如用来防治辣椒炭疽病、水稻纹枯病以及一些镰刀菌引起的病害。枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当其作用于作物或土壤时，能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用，提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。枯草芽孢杆菌的检测分为常规检测方法和快速检测方法。常规检测方法首先要进行细菌增菌培养、分离纯化，通过菌落形态观察、革兰氏染色镜检、生理生化实验等进行鉴定。快速检测方法是运用PCR技术、免疫学技术和酶反应进行快速检测。快速检测具体操作的方法多样，检测速度快，灵敏度高、具有可靠性和准确性，但是样品制备较难、检测过程中需要的仪器水平要求高、试剂昂贵。靶基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶基因区域为16SrRNA或18SrRNA区域。然而对于芽孢杆菌来讲，16S区域相似度较高，仅仅通过该区域并不能准确判断是否为枯草芽孢杆菌。尤其是枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等的16SrRNA基因的相似度在100%，因此在日常农业、水产养殖等检测中，仅仅依靠实验人员的经验观察菌落来区分鉴定，造成很大的检测误差和偏差。利用环介导等温扩增法(LAMP)技术在快速检测某些病原菌及蜡样芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等均有报道，如专利《产气荚膜梭状芽孢杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法》（公开号CN101200761A），利用LAMP技术专利技术了快速检测产气荚膜梭状芽孢杆菌的试剂盒及方法；《环介导等温扩增方法检测绿脓杆菌的试剂盒及方法》（公开号CN101392289A），则是针对病原菌绿脓杆菌的LAMP检测技术的专利技术和应用；《利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法及引物》（公开号CN107475401A），专利技术了一种利用LAMP技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法及引物。但关于枯草芽孢杆菌相关LAMP技术的开发应用却报道较少。
技术实现思路
针对现有技术中关于枯草芽孢杆菌检测中存在的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种利用环介导等温扩增法(LAMP)技术快速检测枯草芽孢杆菌的引物及其应用。本专利技术所述环介导等温扩增法检测枯草芽孢杆菌的引物，是以枯草芽孢杆菌的gyrA基因和gyrB基因为靶序列设计获得。gyrA基因和gyrB基因是在芽孢杆菌等多种细菌中存在的基因序列，是负责编码靶酶DNA促旋酶的保守基因，其变异速率大于16SrRNA，因此适合用于细菌种属之间的鉴定并能反映种属之间的进化关系。枯草芽孢杆菌的gyrA基因和gyrB基因在碱基相似性上存在明显差异，可作为枯草芽孢杆菌快速鉴定的靶基因。其特征在于：所述引物包括一组外引物F3/B3、一组内引物FIP/BIP及一组环引物LF/LB；其核苷酸序列分别如下所示：F3：5’-GCGATTCCAGTCACGG-3’；B3：5’-CGTTTTTCGTTCCAATGATGA-3’；FIP：5’-CGAATTGAGATAGCGATGTTCGTTTATGCGGAGCTTTACCTCT-3’；BIP：5’-ATATCCGCAACAATGGTCTAATTGCTGTTTTGTGCCGTCAGTC-3’；LF：5’-ACCCCATGCTTTGTAGTGAAGA-3’；LB：5’-TGAAGATGATGAACTGATGGGTG-3’。枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，该属包括解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等多种菌种。枯草芽孢杆菌在16S区域的保守性不高。通过比对研究，申请人发现枯草芽孢杆菌的gyrA基因和gyrB基因为高度保守区域，因此，该保守序列（靶向DNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示）适用于特异性检测枯草芽孢杆菌。进一步的，针对该保守序列，申请人设计了本专利技术所述的环介导等温扩增法（LAMP）检测枯草芽孢杆菌的引物，通过多套引物优化实验，确定了具有最佳检测效果的上述引物。本专利技术所述环介导等温扩增法检测枯草芽孢杆菌的引物在检测枯草芽孢杆菌中的应用。本专利技术利用上述引物，采用环介导等温扩增技术检测枯草芽孢杆菌的方法是：提取待测样品的DNA，以所述的DNA为模版，利用所述的引物进行LAMP反应；对反应产物进行鉴定，判断待检测样品中是否含有枯草芽孢杆菌。具体的，所述引物用于检测枯草芽孢杆菌的方法是：（1）提取待测样品基因组DNA；（2）建立环介导等温扩增法（LAMP）反应体系进行反应：以步骤（1）提取的DNA为模板，加入所述外引物物F3/B3、内引物FIP/BIP及环引物LF/LB进行LAMP扩增，加入LAMP反应混合液，61-65℃温度条件下进行反应；（3）反应结果的判定：采用荧光染料目测观察法或实时浊度检测法判定；其中，荧光染料目测观察法判定方法是：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBRGreenI1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即存在枯草芽孢杆菌，橙色或橘黄色的为阴性，即不存在枯草芽孢杆菌；实时浊度检测法判定方法是：观察扩增产物是否出现白色浑浊，出现白色浑浊的判断为阳性，即存在枯草芽孢杆菌，无白色浑浊的为阴性，即不存在枯草芽孢杆菌。上述的应用中，步骤（2）中所述环介导等温扩增法（LAMP）反应体系总体积优选为20μL；包括0.2μM外引物F3/B3，1.6μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环介导等温扩增法检测枯草芽孢杆菌的引物，以枯草芽孢杆菌的gyrA基因和gyrB基因为靶序列设计获得，其特征在于：所述引物包括一组外引物F3/B3、一组内引物FIP/BIP及一组环引物LF/LB；其核苷酸序列分别如下所示：F3：5’‑GCGATTCCAGTCACGG‑3’；B3：5’‑CGTTTTTCGTTCCAATGATGA‑3’；FIP：5’‑CGAATTGAGATAGCGATGTTCGTTTATGCGGAGCTTTACCTCT‑3’；BIP：5’‑ATATCCGCAACAATGGTCTAATTGCTGTTTTGTGCCGTCAGTC‑3’；LF：5’‑ACCCCATGCTTTGTAGTGAAGA‑3’；LB：5’‑TGAAGATGATGAACTGATGGGTG‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种环介导等温扩增法检测枯草芽孢杆菌的引物，以枯草芽孢杆菌的gyrA基因和gyrB基因为靶序列设计获得，其特征在于：所述引物包括一组外引物F3/B3、一组内引物FIP/BIP及一组环引物LF/LB；其核苷酸序列分别如下所示：F3：5’-GCGATTCCAGTCACGG-3’；B3：5’-CGTTTTTCGTTCCAATGATGA-3’；FIP：5’-CGAATTGAGATAGCGATGTTCGTTTATGCGGAGCTTTACCTCT-3’；BIP：5’-ATATCCGCAACAATGGTCTAATTGCTGTTTTGTGCCGTCAGTC-3’；LF：5’-ACCCCATGCTTTGTAGTGAAGA-3’；LB：5’-TGAAGATGATGAACTGATGGGTG-3’。2.权利要求1所述环介导等温扩增法检测枯草芽孢杆菌的引物在检测枯草芽孢杆菌中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物用于检测枯草芽孢杆菌的方法是：（1）提取待测样品基因组DNA；（2）建立环介导等温扩增法（LAMP）反应体系进行反应：以步骤（1）提取的DNA为模板，加入所述外引物物F3/B3、内引物FIP/BIP及环引物LF...
【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，杨春玉，吕佩文，程彬，
申请(专利权)人：山东省产品质量检验研究院，山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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