阴沟肠杆菌多种血清型特异引物及多重PCR检测方法技术

本发明专利技术提供了用于检测阴沟肠杆菌共26个O抗原血清型的特异寡核苷酸序列及其应用，所述寡核苷酸包括：（1）阴沟肠杆菌O1型、O3‑O22型、O24型、O26‑O27型、O30型的wzy基因中各自选取的2段DNA片段，如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:46所示；（2）阴沟肠杆菌O23型的wzt基因中选取的2段DNA片段，如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示。本发明专利技术还建立了一套利用上述寡核苷酸，检测阴沟肠杆菌26个O抗原血清型的多重PCR检测系统及检测方法，首次建立了利用分子生物学手段对阴沟肠杆菌进行血清学分型技术，对于这一重要致病菌的临床检测和流行病学监测具有重要意义。

Detection of Enterobacter cloacae by multiple serotype-specific primers and multiplex PCR

【技术实现步骤摘要】
阴沟肠杆菌多种血清型特异引物及多重PCR检测方法
本专利技术属于细菌检测方法
，涉及一种多重PCR的检测方法及其应用，尤其涉及一种可同时检测阴沟肠杆菌26个O抗原血清型的多重PCR技术及其所用的引物序列。
技术介绍
血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用，至今已有超过80年的历史，可在种/属内将细菌进一步分类，是一种重要的细菌鉴定方法，目前，血清学鉴定方法是使用最为普遍的致病菌鉴定和溯源方法。细菌的血清学鉴定在细菌鉴定和分类体系中，位于种/属水平的鉴定和菌株水平的鉴定（噬菌体分型、MLST、PFGE等）之间，为细菌的种/属内分类提供了重要的框架。细菌的血清型与致病性密切相关，同一种内不同血清型细菌的致病性往往存在着很大差异。传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：1）建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长；2）抗血清的生产和质控较为困难；3）很多抗血清国际上只有少数几家单位生产和保存，且用于鉴定的抗血清严重不全；4）血清学鉴定的实验过程耗时较长（2-6天）。上述缺陷严重限制了致病菌早期诊断的效率，为传染病的流行和暴发埋下了隐患。细菌表面多糖抗原主要包括O多糖（O抗原）、普通抗原（CA）、胞外多糖抗原、芽孢、以及荚膜多糖（K抗原）等。上述细菌表面多糖抗原在细菌和外部环境的相互作用中扮演着非常重要角色。特别是他们常常是免疫系统对入侵的致病菌的首要识别及攻击目标，同时也在致病性细菌黏附，侵染宿主细胞以及躲避宿主细胞的免疫攻击的过程中起着重要的作用。其中，O抗原位于细菌表面脂多糖（LPS）的最外层，一般由寡糖重复单位（≦50）组成，每个重复单位通常由三到八个单糖组成。构成O抗原的单糖包括自然界的常见糖（戊糖，己糖等）和罕见糖（6-脱氧己糖，3，6-双脱氧糖，己酰氨基脱氧糖等），以及它们的衍生物。O抗原结构由于构成重复单位的单糖种类、排列顺序、结合方式及多糖链的空间结构不同而不同，因而具有高度的多样性。根据O抗原的多样性，细菌可被分为不同的血清型。不同O抗原之间的区别几乎完全取决于O抗原基因簇的遗传学多样性。上述O抗原基因簇中，其内部基因按照行使功能的不同可分为3类：单糖合成酶基因，糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。在深入分析细菌表面多糖抗原进化机理的基础上，Wang和Reeves提出了O抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因（wzx和wzy）最具血清型特异性的这一理论，并以此为基础建立了从细菌多糖抗原基因簇中筛选特异分子标识的技术，对于建立细菌可靠的分子分型体系具有重要意义。应用这一理论，基于不同分子生物学手段和针对不同致病菌的分子血清学分型手段被开发出来。自从上世纪80年代以来，阴沟肠杆菌(Enterobactercloacea)引起的感染日益增多，且耐药性高，病死率高，成为国内外院内感染重要的病原菌。其引起的细菌感染性疾病，常累及多个器官系统，包括皮肤、软组织、呼吸道、泌尿道、中枢神经系统、胃肠道和其他器官鵻的感染。由于阴沟肠杆菌能产生超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶引起严重的耐药性，给临床治疗带来了新的挑战。在美国肠杆菌属造成的医院感染菌血症占5%～7%；在ICU分别占常见呼吸道感染的第三位、尿路感染第五位、手术伤口感染第四位，其中最常见的是阴沟肠杆菌和产气肠杆菌感染。在我国，阴沟肠杆菌感染率(14.8-15.2%)在ICU感染革兰阴性杆菌中始终位列前3位。细菌的血清型与致病性密切相关，在流行病学调查时，除对一般临床资料、病菌的耐药状况进行监测外，对感染病菌分型以了解菌株亲缘关系，确认传染源及感染流行形式有重要意义。近年来，国内外陆续有文章报道了阴沟肠杆菌耐药基因的流行病学调研结果。相比之下，对阴沟肠杆菌的分型诊断技术的研究及分型检测用特异分子标识的研究则处于相对滞后状态，临床中缺少对院内感染该菌的亲缘关系检测方法，从而影响了临床对由阴沟肠杆菌造成的医院感染的早诊断、早预防和早控制。80年代以来，国外陆续有文献报道了对阴沟肠杆菌进行血清型分型、噬菌体分型、细菌素分型，以及生物型分型等手段。但以上现有分型方法只能联合使用，单独使用一种方法分型能力弱，分型重现性不理想，不能很好地将阴沟肠杆菌进行准确分型，难以满足临床需求。1960年，SakazakiandNamioka等为阴沟肠杆菌建立了由53个O抗原群、56个H抗原及79个血清型组成的抗原表，但该分型方法并没有能用于流行病学调查。此后，Gaston等通过抗原抗体的免疫凝集反应，重新建立了阴沟肠杆菌的血清型分型体系，共包括28个O抗原血清型，这一分型体系随后被扩展为30个，并使用至今。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对阴沟肠杆菌26个O抗原血清型的多重PCR快速检测技术，为这种致病菌的快速检测和血清型分型提供有效的技术手段。涉及一种可同时检测阴沟肠杆菌O1型、O3-O22型、O24型、O26-O27型、O30型和O23型，共26种O抗原血清型的所应用的PCR引物序列及多重PCR检测方法。所述的PCR引物序列包括：（1）阴沟肠杆菌O1型、O3-O22型、O24型、O26-O27型、O30型的wzy基因中各自选取的2段DNA片段，如SEQIDNO:1至SEQIDNO:46所示；（2）阴沟肠杆菌O23型的wzt基因中选取的2段DNA片段，如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48所示。上述SEQIDNO:1至SEQIDNO:48所示的核苷酸序列如下：SEQID(5'-3')NO:1GATGGCTTCAAATCAAGTAGT扩增阴沟肠杆菌O1型wzy基因的上游引物NO:2AAGATAAGTGGTTAGCACGAGG扩增阴沟肠杆菌O1型wzy基因的下游引物NO:3TGATGGCTATTCTGCTCTGG扩增阴沟肠杆菌O3型wzy基因的上游引物NO:4TTCCCAACCACCGTAGCC扩增阴沟肠杆菌O3型wzy基因的下游引物NO:5TGCTCCTGCTGAAGGTGTC扩增阴沟肠杆菌O4型wzy基因的上游引物NO:6ATGGCAGTTCCTATTATTCCG扩增阴沟肠杆菌O4型wzy基因的下游引物NO:7AGTTTCGTTTGCTTGGCTC扩增阴沟肠杆菌O5型wzy基因的上游引物NO:8TTCTCCCACGGTCCTCTGT扩增阴沟肠杆菌O5型wzy基因的下游引物NO:9TATGAAAACAATCGGTTACGC扩增阴沟肠杆菌O6型wzy基因的上游引物NO:10GCCAATCTATACCAACCAACAT扩增阴沟肠杆菌O6型wzy基因的下游引物NO:11CTGTTCGTCTTCTTGTTAATCGT扩增阴沟肠杆菌O7型wzy基因的上游引物NO:12ATAATCTAATGTGTATCCCCTG扩增阴沟肠杆菌O7型wzy基因的下游引物NO:13TCCCTGTATTACTTTTATTTAGC扩增阴沟肠杆菌O8型wzy基因的上游引物NO:14GCTGAGGTAATTAGAGGTCTAA扩增阴沟肠杆菌O8型wzy基因的下游引物NO:15AGCGTTTATATATTTCCTGCTTACT扩增阴沟肠杆菌O9型、O10型、O11型wzy基因的上游引物NO:16GCTATCCCATTAGACACGCT扩增阴沟肠杆菌O9型、O10型、O11型wzy本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测阴沟肠杆菌共26个O抗原血清型特异性PCR引物，其特征在于（1）从阴沟肠杆菌O1型、O3‑O22型、O24型、O26‑O27型、O30型的

【技术特征摘要】
1.用于检测阴沟肠杆菌共26个O抗原血清型特异性PCR引物，其特征在于（1）从阴沟肠杆菌O1型、O3-O22型、O24型、O26-O27型、O30型的wzy基因中各自选取的2段DNA片段，如SEQIDNO:1至SEQIDNO:46所示；（2）从阴沟肠杆菌O23型的wzt基因中选取的2段DNA片段，如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48所示。2.权利要求1所述用于检测阴沟肠杆菌共26个O抗原血清型特异性P...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玺，李雅玥，许琮，王晓彤，
申请(专利权)人：南开大学，天津市第三中心医院，
类型：发明
国别省市：天津,12