一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法。该生物传感器包括RPA反应试剂、SDA反应试剂和显色试剂。本发明专利技术基于重组链替代反应对沙门氏菌的双链核酸进行扩增，得到带有富G序列和切刻酶识别位点的dsDNA。Nt.Bst NBI切刻酶特异性识别酶切位点并进行切割，在Bst DNA聚合酶的作用下，形成切口的DNA链将会延伸，将DNA链上的G‑四联体替换下来。释放出的G‑四联体与Hemin结合，形成G4 DNAzyme，可催化H2O2将无色的TMB氧化为肉眼可见的蓝色oxTMB，进而通过颜色变化和吸光值的改变对沙门氏菌进行检测。

A Biosensor and Method for Quantitative Detection of Salmonella

【技术实现步骤摘要】
一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法。
技术介绍
沙门氏菌是可引起人畜共同患病的因素之一，也一直是造成食品加工贮藏中污染的主要致病菌之一。作为一种食源性致病菌，沙门氏菌感染对象十分广泛，当其进入宿主体内后会引起宿主产生发热、腹泻、呕吐等一系列疾病，统称为沙门氏菌病，其在由细菌引起的食源性疾病中居首位。目前沙门氏菌的检测方法主要包括传统国标法、免疫学检测方法以及分子生物学检测方法等。常见的分子生物学检测方法包括变温核酸扩增技术、等温核酸扩增技术、基因芯片技术等。生物传感器检测方法相对于传统的检测方法具有检验速度快、灵敏度高、能进行现场检测等优点。对于一系列核酸扩增技术，包括：PCR技术、RCA技术、HCR技术、RPA技术等，RPA技术是在多酶体系下进行的一种恒温体外扩增技术，最早是在2006年由英国公司TwistDx研发的，既可以检测DNA又可以检测RNA。自专利技术以来，RPA技术已经在医疗诊断、食品中致病微生物的检测分析以及生物安全等方面崭露头角。尤其是在2014年以后，RPA商业化试剂盒的问世直接推动RPA技术得到快速的发展。目前为止，RPA的扩增方法主要有三种：基础的RPA扩增、实时荧光定量RPA和侧流层析试纸条RPA。RPA技术一般在20min就可以完成，其灵敏度较高且特异性较强，所用仪器简单便捷，可以满足现场检测的需求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法。本专利技术具有操作简便、可视化、通用性、耗时短、敏感性高等特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器，包括RPA反应试剂、SDA反应试剂和显色试剂；RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQIDNO：3所示的上游引物、序列如SEQIDNO：2所示的下游引物、序列如SEQIDNO：5所示的通用引物、乙酸镁和水。在SDA技术中，切刻酶Nt.BstNBI是一种能特异性识别双链DNA但只对特定序列(GAGTC)所在的单链DNA进行切割的一种核酸内切酶。BstDNA聚合酶具有5’→3’的聚合酶活性和强链置换活性，但不具有3’→5’的外切酶活性。在切刻酶和聚合酶的共同作用下，可产生大量的单链DNA片段，实现信号放大。作为特异性功能性核酸，富含鸟嘌呤(G)的序列与氯高铁血红素(Hemin)组合时可形成配位络合物(G4DNAzyme)，其具有类过氧化物酶催化活性。该复合物的催化活性比单独的Hemin高约10倍，显着改善了Hemin本身的催化性能。G4DNAzyme已广泛用于催化H2O2调节的氧化还原反应。例如，它可催化H2O2将无色的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)氧化为蓝色的氧化TMB(oxTMB)。该显色原理简单、快速且不需要酶催化，已广泛应用于比色生物传感器的构建。本专利技术提供一种沙门氏菌检测方法，将重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和链置换扩增反应(SDA)相结合，构建了一种基于通用接头重组链替代反应检测沙门氏菌的可视化生物传感器。基于重组链替代反应对沙门氏菌的双链核酸进行扩增，得到带有富G序列和切刻酶识别位点的dsDNA。Nt.BstNBI切刻酶特异性识别酶切位点并进行切割，在BstDNA聚合酶的作用下，形成切口的DNA链将会延伸，将DNA链上的G-四联体替换下来。释放出的G-四联体与Hemin结合，形成G4DNAzyme，可催化H2O2将无色的TMB氧化为肉眼可见的蓝色oxTMB，进而通过颜色变化和吸光值的改变对沙门氏菌进行检测。在本专利技术中，序列如SEQIDNO：5所示的通用引物含有富G序列的互补序列和切刻酶识别位点序列如SEQIDNO：5所示的通用引物。在本专利技术中，SDA反应试剂包括Nt.BstNBI切刻酶、Bst.DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和水。在本专利技术中，显色试剂包括缓冲液、Hemin、TMB显色剂和H2SO4。在本专利技术中，TMB显色剂中含有TMB和H2O2。本专利技术还提供了一种沙门氏菌的检测方法，采用上述生物传感器检测沙门氏菌，包括RPA反应、SDA反应和显色反应。作为优选，RPA反应的体系如下：优选地，RPA反应的体系如下：作为优选，RPA反应的条件为：38～40℃反应18～22min。优选地，RPA反应的条件为：39℃反应20min。作为优选，SDA反应的体系为：优选地，SDA反应的体系为：作为优选，SDA反应的条件为：54～56℃反应38～42min，94～96℃灭活4～6min，3～5℃保存4～6min。优选地，SDA反应的条件为：55℃反应40min，95℃灭活5min，4℃保存5min。作为优选，显色反应的体系为：优选地，显色反应的体系为：作为优选，显色反应的条件：SDA反应产物、Hemin、缓冲液在36～38℃下孵育14～16min，加入TMB显色剂后在36～38℃下显色6～8min，最后加入H2SO4终止反应。优选地，显色反应的条件：SDA反应产物、Hemin、缓冲液在37℃下孵育15min，加入TMB显色剂后在37℃下显色7min，最后加入H2SO4终止反应。本专利技术提供了一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法。该生物传感器包括RPA反应试剂、SDA反应试剂和显色试剂；RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQIDNO：3所示的上游引物、序列如SEQIDNO：2所示的下游引物、序列如SEQIDNO：5所示的通用引物、乙酸镁和水。本专利技术基于通用接头重组链替代反应的用于检测沙门氏菌的可视化生物传感器具有以下优点：(1)通用接头的设计：经过RPA扩增后可使扩增产物带有切刻酶的识别序列和富G序列，经过链替代扩增反应可实现信号的放大和输出。(2)一步法进行反应：在整个链替代扩增过程都在同一个反应体系中进行，可避免外界的污染，减少了假阳性的产生。(3)可视化：由于通用接头的引入，使扩增产物带有富G序列，经过链替代反应后，富G序列被置换下来，在Hemin的作用下形成G-四联体，可使TMB显色，通过肉眼观察实现对沙门氏菌的半定量检测，通过在450nm处测量样品的吸光值，实现对沙门氏菌的定量检测。(4)通用性：通过改变RPA的引物序列，再加入构建好的通用接头，实现对其他靶标物质的检测。(5)耗时短：该生物传感器可在90min左右完成对沙门氏菌的检测。附图说明图1为不同比例引物进行RPA扩增的结果；其中，泳道1引物比为SDA-F’：SDA-R：SDA-JT＝1:2:1；泳道2引物比为SDA-F’：SDA-R：SDA-JT＝1:3:2；泳道3引物比为SDA-F：SDA-R’：SDA-JT＝2:1:1；泳道4引物比为SDA-F：SDA-R’：SDA-JT＝3:1:2；泳道5引物比为SDA-F’：SDA-R’＝1:1；泳道6的引物比为SDA-F’：SDA-R’：SDA-JT＝1:1:2泳道7为SDA-F：SDA-R＝1:1；图2为不同引物长度优化的结果；(A)不同长度引物进行RPA扩增的结果；其中，泳道1所用上游引物为SDA-F1；泳道2所用上游引物为SDA-F2；泳道3所用上游引物为SDA-F’；泳道4所用上游引物为SDA-F3；泳道5所用上游引物为S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器，其特征在于，包括RPA反应试剂、SDA反应试剂和显色试剂；所述RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物、序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物、序列如SEQ ID NO：5所示的通用引物、乙酸镁和水。

【技术特征摘要】
1.一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器，其特征在于，包括RPA反应试剂、SDA反应试剂和显色试剂；所述RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQIDNO：3所示的上游引物、序列如SEQIDNO：2所示的下游引物、序列如SEQIDNO：5所示的通用引物、乙酸镁和水。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述SDA反应试剂包括Nt.BstNBI切刻酶、Bst.DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和水。3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述显色试剂包括缓冲液、Hemin、TMB显色剂和H2SO4。4.一种沙门氏菌的检测方法，其特征在于，采用权利要求1至3中任一项所述生物传感器检测沙...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，田洪涛，罗云波，张媛，李舒婷，田晶晶，朱龙佼，杜再慧，
申请(专利权)人：中国农业大学，河北农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11