肉乳中骆驼和奶牛源性同步检测的引物和探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种肉乳中骆驼和奶牛源性同步检测的引物和探针及试剂盒，引物和探针序列如下：骆驼源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；奶牛源性检测正向引物序列如SEQ ID No.2所示；骆驼源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示；奶牛源性检测反向引物序列如SEQ ID No.4所示；骆驼探针序列如SEQ ID No.5所示；奶牛探针序列如SEQ ID No.6所示；质控探针序列如SEQ ID No.7所示。本发明专利技术的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现肉乳中骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测，并且可以进行骆驼源性和奶牛源性的定量检测。

Primers, Probes and Kits for Simultaneous Detection of Camel and Dairy Cow Sources in Meat Milk

【技术实现步骤摘要】
肉乳中骆驼和奶牛源性同步检测的引物和探针及试剂盒
本专利技术属于食品检测
，尤其涉及肉和乳中的动物源性检测领域。
技术介绍
骆驼是一种能在高温、干旱等恶劣气候条件下生存繁衍的哺乳动物。目前，骆驼仍然是沙漠居民日常生活中至关重要的食物来源和交通工具。而骆驼奶类似于人奶，具有较高的营养价值。据报道，驼奶除了较高的营养价值外，还具有较广的医疗和健康潜质，包括血管紧张素转换酶抑制活性作用，降胆固醇、降血压、降血糖作用，抗菌和低过敏性作用和抗糖尿病作用。此外，骆驼奶还可以降低患心脏病、癌症和自闭症的风险。上述营养价值和医疗价值使得驼奶与其他乳类相比存在较大的价格差异。诱人的利益使得人们在骆驼乳制品中掺入牛奶(鲜奶、酸奶、奶酪、奶粉和奶类饮料)。这些掺假行为不仅严重违反了市场公平竞争的原则，还破坏了消费者和商家之间的信任。更重要的是，有些人对牛奶过敏，摄入掺有牛源性物质的乳制品可能会危害他们的健康。至今为止，人们研究出了很多关于肉乳制品的掺假鉴定方法。其中基于DNA的方法在肉乳制品中动物源性物种的鉴定方面表现出较强的特异性和较高的灵敏度。目前还没有有关骆驼和奶牛在肉乳制品中的源性检测的报道，并且肉乳制品真伪鉴别相关的技术研究、检测标准、专利技术专利以及商业试剂盒主要集中在单一通道单一源性检测和异管质控检测，同时多通道多源性检测和同管质控检测报道较少。假阴性一直是困扰PCR技术在肉乳制品真伪鉴别中广泛应用的瓶颈。同管质控检测可以有效的防止假阴性的发生。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的肉乳中的骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测的引物、探针及试剂盒和方法，解决肉乳中的骆驼和奶牛源性成分定性和定量检测问题。本专利技术的技术方案为：肉乳中的骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测的引物和探针，引物和探针序列如下：骆驼源性检测正向引物：5'TTGAACTAGGCCATGGAGC3'(SEQIDNo.1)，奶牛源性检测正向引物：5'TTGAATTAGGCCATGAAGC3'(SEQIDNo.2)，骆驼源性检测反向引物：5'CTTACCTTGTTACGACTTATCTC3'(SEQIDNo.3)，奶牛源性检测反向引物：5'CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC3'(SEQIDNo.4)，骆驼探针：5'TTCTCATACGTTTTGCACTTATTTAT3'(SEQIDNo.5)，奶牛探针：5'CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG3'(SEQIDNo.6)，质控探针：5'ACACACCGCCCGTCACCCT3'(SEQIDNo.7)。进一步地，骆驼探针、奶牛探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。作为本专利技术的另一目的，提供了一种肉乳中的骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的骆驼源性检测正向引物，SEQIDNo.2所示的奶牛源性检测正向引物，SEQIDNo.3所示的骆驼源性检测反向引物，SEQIDNo.4所示的奶牛源性检测反向引物，SEQIDNo.5所示的骆驼探针，SEQIDNo.6所示的奶牛探针，SEQIDNo.7所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，骆驼阳性标准品，奶牛阳性标准品。当然，也可以单独检测骆驼源性，为了节省成本，只需要去除奶牛源性相关的试剂即可(SEQIDNo.2所示的奶牛源性检测正向引物、SEQIDNo.4所示的奶牛源性检测反向引物、SEQIDNo.6所示的奶牛探针和奶牛阳性标准品)因此，作为本专利技术的另一目的，还提供了一种肉乳中的骆驼源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的骆驼源性检测正向引物，SEQIDNo.3所示的骆驼源性检测反向引物，SEQIDNo.5所示的骆驼探针，SEQIDNo.7所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，骆驼阳性标准品。当然，也可以单独检测奶牛源性，为了节省成本，只需要去除骆驼源性相关的试剂即可(SEQIDNo.1所示的骆驼源性检测正向引物、SEQIDNo.3所示的骆驼源性检测反向引物、SEQIDNo.5所示的骆驼探针和骆驼阳性标准品)因此，作为本专利技术的另一目的，还提供了一种原奶中奶牛源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：SEQIDNo.2所示的奶牛源性检测正向引物，SEQIDNo.4所示的奶牛源性检测反向引物，SEQIDNo.6所示的奶牛探针，SEQIDNo.7所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，奶牛阳性标准品。肉乳中的骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测的方法，步骤如下：(1)提取肉乳中的DNA；(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μL；(3)利用SEQIDNo.1～SEQIDNo.7的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用骆驼和奶牛阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；(4)Real-timePCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取骆驼、奶牛和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤40和阳性对照Ct≤40，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤40，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤40，结果判定为具有相应两源性；(5)利用骆驼和奶牛阳性标准品做DNA定量的标准曲线；(6)利用检测肉乳中的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉乳中相应源性的定量检测结果。进一步地，Real-timePCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，34s，40循环。进一步地，Real-timePCR反应体系为：ProbeqPCR预混液10μL、SEQIDNo.1所示的骆驼源性检测正向引物0.5μL，浓度为10μM；SEQIDNo.2所示的奶牛源性检测正向引物0.5μL，浓度为10μM；SEQIDNo.3所示的骆驼源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μM；SEQIDNo.4所示的奶牛源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μM；SEQIDNo.5所示的骆驼探针0.5μL，浓度为10μM；、SEQIDNo.6所示的奶牛探针0.5μL，浓度为10μM和SEQIDNo.7所示的质控探针0.5μL，浓度为10μM；DNA模板2μL，灭菌的去离子水4.5μL，总体积20μL。本专利技术通过比对骆驼、黄牛、山羊、绵羊、水牛、牦牛、猪、马、驴、鸡、鸭、火鸡、兔、狗、鸽子及鹌鹑等16种动物的线粒体基因组，每种动物选取多个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述序列，筛选出骆驼和奶牛保守和特异的序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个PCR反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肉乳中骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：骆驼源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示，奶牛源性检测正向引物序列如SEQ ID No.2所示，骆驼源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示，奶牛源性检测反向引物序列如SEQ ID No.4所示，骆驼探针序列如SEQ ID No.5所示，奶牛探针序列如SEQ ID No.6所示，质控探针序列如SEQ ID No.7所示。

【技术特征摘要】
1.肉乳中骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：骆驼源性检测正向引物序列如SEQIDNo.1所示，奶牛源性检测正向引物序列如SEQIDNo.2所示，骆驼源性检测反向引物序列如SEQIDNo.3所示，奶牛源性检测反向引物序列如SEQIDNo.4所示，骆驼探针序列如SEQIDNo.5所示，奶牛探针序列如SEQIDNo.6所示，质控探针序列如SEQIDNo.7所示。2.根据权利要求1所述的肉乳中骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，骆驼探针、奶牛探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。3.肉乳中骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的骆驼源性检测正向引物，SEQIDNo.2所示的奶牛源性检测正向引物，SEQIDNo.3所示的骆驼源性检测反向引物，SEQIDNo.4所示的奶牛源性检测反向引物，SEQIDNo.5所示的骆驼探针，SEQIDNo.6所示的奶牛探针，SEQIDNo.7所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，骆驼阳性标准品，奶牛阳性标准品。4.肉乳中的骆驼源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的骆驼源性检测正向引物，SEQIDNo.3所示的骆驼源性检测反向引物，SEQIDNo.5所示的骆驼探针，SEQIDNo.7所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，骆驼阳性标准品。5.原奶中奶牛源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：SEQIDNo.2所示的奶牛源性检测正向引物，SEQIDNo.4所示的奶牛源性检测反向引物，SEQIDNo.6所示的奶牛探针，SEQIDNo.7所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，奶牛阳性标准品。6.肉乳中骆驼源性、奶牛源性以及质控同管检测的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭梁，海小，徐伟良，李春冬，多拉娜，刘国强，罗建兴，郭元晟，
申请(专利权)人：锡林郭勒职业学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15