一种快速检测鉴定茶黄蓟马的LAMP引物组及方法技术

本发明专利技术涉及生物监测、检测鉴定及害虫防治技术领域，公开了一种快速检测鉴定茶黄蓟马的LAMP引物组及检测方法。本发明专利技术针对茶黄蓟马Scirtothrips dorsalis基因序列设计和筛选了一套特异性检测引物组，该引物组由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LoopF、反向环引物LoopB组成；检测方法仅需对样本进行简单虫体刺穿处理、无需提取核酸即可进行LAMP特异性检测。本发明专利技术筛选的引物灵敏高、特异性强；建立的检测方法无需提取核酸、操作简便、对环境设施设备要求不高，可在田间或出入境现场直接进行检测，仅需10分钟左右即可获得检测结果，且结果准确。

A Rapid Detection and Identification Method for LAMP Primers of Thrips Thea

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测鉴定茶黄蓟马的LAMP引物组及方法
本专利技术涉及生物监测、检测鉴定及害虫防治
，具体是一种快速检测鉴定茶黄蓟马的LAMP引物组、检测方法和在出入境农产品检测、农作物生产中茶黄蓟马的早期监测、检测和鉴定中的应用。
技术介绍
茶黄蓟马ScirtothripsdorsalisHoods属缨翅目Thysanoptera、蓟马科Thripidae、硬蓟马属Scirtothrips。最初起源于东南亚或印度，在最近二十年中已迅速扩散为全球性分布，是一种全球性的重要入侵害虫。其寄主范围非常广，已记载的寄主有40科100多种植物，主要为害植株的幼叶与幼果，严重时导致植物生长不良，甚至死亡，此外茶黄蓟马还可传播番茄斑萎病毒属Tospovirus、等轴不稳定环斑病毒组Ilarvirus、菜豆金色花叶病毒属Begomovirus的八种植物病毒。对寄主植物产量的直接损失严重时可达90％以上。欧盟等地区与国家均将其列为检疫性有害生物名单。因此对茶黄蓟马开展分子生物学检测方法研究，建立能够准确、快速的快速检测鉴定方法对于进出境植物及植物产品快速通关，保护我国农业与生态安全、促进农产品出口，以及田间防控的早期监测从而及时防治非常迫切与重要。目前茶黄蓟马的检测鉴定技术主要有两种：一种是形态特征鉴定，形态特征鉴定是昆虫鉴定最常用的方法，但其对于茶黄蓟马的鉴定具有一定的局限性，首先，茶黄蓟马体型微小,成虫体长小于1mm，蓟马近似种之间的区别特征少且不明显，必须制作玻片进行镜检并且对制片技术具有很高要求，因此对鉴定人员的专业性要求很高；其次，蓟马分类一般以成虫的外部形态作为鉴定依据，而在未成熟时期(卵、若虫)的分类，由于形态的不稳定或特征不明显而难以鉴定分类。而且这时的茶黄蓟马有可能处于未成熟时期，因此更增加蓟马形态鉴定的困难度。目前对发现未成熟时期的茶黄蓟马，常需饲养至成虫方能从事鉴定，如此不但耗时，而且蓟马饲养方法不甚成熟，且在发现的虫口数量常不多的情况下，能顺利饲养至成虫的比率甚低。另外一种是核酸分子检测法，主要为常规PCR法，该方法需要通过对不同生长阶段的茶黄蓟马均可进行检测鉴定，但这种检测方法检测时间较长，需要在专业的检测实验室中进行操作、依赖精密、贵重的设施设备，检测过程包括核酸提取、酸扩增、凝胶成像等程序繁琐的步骤且需要专业的技术人员进行操作，因此也提高了检测成本并限制了其应用范用，不适合口岸、与田间等现场推广使用。LAMP荧光检测技术是核酸体外扩增与荧光法技术的结合，在恒温条件下进行，通过添加特殊的DNA聚合酶和特异性引物，在扩增的同时加入荧光基团，通过荧光信号累积实时监控扩增过程，实现核酸快速扩增和检测，并对产物做溶解曲线分析。其具有所需实验条件简单，前处理要求低，特异性强、扩增速度快等优点，可广泛应用于食品、医药、农业等领域，在昆虫的检测中报道较少，而对于茶黄蓟马的LAMP荧光检测方法的建立目前还没有报道。本专利技术利用茶黄蓟马的ITS2基因序列特征设计了6条特异性的LAMP荧光检测引物，在此基础上建立了茶黄蓟马的LAMP荧光检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测鉴定茶黄蓟马的LAMP引物组及方法，针对现月技术中对茶黄蓟马检测和鉴定中主要基于形态学特征，对专业人员技术要求高、程序繁琐、耗时长等特点，以及现有PCR分子检测需要在专业的检测实验室中进行操作、依赖精密、贵重的设施设备，检测过程繁琐以及成本高等问题，难以做到对有害生物的及时监测、检测鉴定，提供了茶黄蓟马的LAMP荧光检测引物组与检测方法，前处理简单、灵敏高、准确度高、检测周期高、实现各种类型现场快速检测。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：茶黄蓟马LAMP荧光检测特异性引物的设计：通过对茶黄蓟马Scirtothripsdorsalis与其他蓟马科Thripidae的ITS2基因序列进行比对分分析，利用LAMPDesigner软件(http://www.optigene.co.uk/lamp-designer/)设计了多套并实验筛选了一套茶黄蓟马特异性荧光检测引物组，由下列引物组成：正向内引物FIP：GCGGAGACTCCAATCTCGTCACTCAACGACCAGACTGT；反向内引物BIP：CTCACGGCGTGGTACTCTTAATTCCGTGCAGCGATATC；正向外引物F3：GGCCACACCTGACTGA；反向外引物B3：CAAGCGAACGAGACAAGT；正向环引物LoopF：CGCCACGAGTGACACA；反向环引物LoopB：AAAGTGAGTGTGGGCTCG。作为本专利技术进一步的方案：所述引物组采用茶黄蓟马的ITS2作为靶基因。一种快速检测鉴定茶黄蓟马的方法，包括如下步骤：(1)引物合成：选择专业的引物合成公司合成引物；(2)样本前处理：将茶黄蓟马转移到滴有10μlTNES提取液的载玻片上，将其载玻片放在解剖镜下，调至视野范围内，先用无菌的微针将蓟马的翅展向身体的两侧，而后再用微针从蓟马腹部进行刺穿，将刺过的蓟马放入事先装有10μl提取液的2ml的离心管中，而后用移液器吸取40μl的提取液冲洗针头滴入离心管中，再取40μl提取液来回的冲洗载玻片上放蓟马的位置，连同原来的的10μl提取液一同吸入离心管中作为样本模板待用；(3)LAMP特异性检测：使用IsothermalMasterMix反应试剂盒，25μl反应体系进行扩增，采用上述的LAMP引物组进行LAMP检测。作为本专利技术进一步的方案：步骤(2)中，微针采用昆虫针中的“00”号针。作为本专利技术进一步的方案：步骤(2)中，穿刺次数为4-6下。作为本专利技术进一步的方案：步骤(3)中，25μl反应体系的具体配置为：1×的IsothermalMasterMix15μl，5μmol/lF3和B3引物各1μl，40μmol/lFIP和BIP引物各1μl，20μmol/lLF和LB引物各1μl，样本模板2μl，加ddH2O补足至25μl。作为本专利技术进一步的方案：步骤(3)中，采用GENIEⅡ便携式基因荧光扩增仪进行扩增。作为本专利技术再进一步的方案：步骤(3)中，LAMP检测反应条件为，63℃反应30min，最后反应温度升高至98℃，以0.05℃/s的速度降温至80℃作熔解曲线，反应5min，然后终止反应。与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：1、操作简单、应用性强：本专利技术的最大优点是不需要以往PCR检测中繁琐的操作步骤与规程，无需提取核酸，操作简单；不需要以往PCR检测中所需要的专业检测环境与PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等专业精密的仪器设备，仅需一台便携式LAMP荧光检测仪，便于各类现场检测，便于基层推广使用；2、特异性强、灵敏度高、结果准确：本专利技术设计的引物组是本技术的关键，该引物根据茶黄蓟马ITS2基因序列设计得到，引物包含6条特异性引物，可识别靶标序列上的6个独立区域，任何一个区域与引物不匹配均不能进行扩增；可对茶黄蓟马各个虫态进行实时检测，具有很高的灵敏性；且经过多次重复验证，结果准确；3、检测快速：应用本专利技术检测方法，仅需十几分钟即可得到检测结果，大大缩短了检测时间。附图说明图1为茶园常见5种蓟马虫体的LAMP反应。图2为茶园常见5种蓟马DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测鉴定茶黄蓟马的LAMP引物组，其特征在于，由下列引物组成：正向内引物FIP：GCGGAGACTCCAATCTCGTCACTCAACGACCAGACTGT；反向内引物BIP：CTCACGGCGTGGTACTCTTAATTCCGTGCAGCGATATC；正向外引物F3：GGCCACACCTGACTGA；反向外引物B3：CAAGCGAACGAGACAAGT；正向环引物LoopF：CGCCACGAGTGACACA；反向环引物LoopB：AAAGTGAGTGTGGGCTCG。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测鉴定茶黄蓟马的LAMP引物组，其特征在于，由下列引物组成：正向内引物FIP：GCGGAGACTCCAATCTCGTCACTCAACGACCAGACTGT；反向内引物BIP：CTCACGGCGTGGTACTCTTAATTCCGTGCAGCGATATC；正向外引物F3：GGCCACACCTGACTGA；反向外引物B3：CAAGCGAACGAGACAAGT；正向环引物LoopF：CGCCACGAGTGACACA；反向环引物LoopB：AAAGTGAGTGTGGGCTCG。2.根据权利要求1所述的一种快速检测鉴定茶黄蓟马的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组采用茶黄蓟马的ITS2作为靶基因。3.一种快速检测鉴定茶黄蓟马的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）引物合成：选择专业的引物合成公司合成引物；（2）样本前处理：将茶黄蓟马转移到滴有10µlTNES提取液的载玻片上，将其载玻片放在解剖镜下，调至视野范围内，先用无菌的微针将蓟马的翅展向身体的两侧，而后再用微针从蓟马腹部进行刺穿，将刺过的蓟马放入事先装有10µl提取液的2ml的离心管中，而后用移液器吸取40µl的提取液冲洗针头滴入离心管中，再取40µl提取液来回的冲洗载玻片上放蓟马的位置，连同原来的的10µl提取液一同吸入离心管中作为样本模板待用；（3）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）简单处理的样本作为模反，利用权利要求1所述的引物组进...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽莉，李茵，罗省根，刘英，
申请(专利权)人：南昌师范高等专科学校，
类型：发明
国别省市：江西,36