一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法技术

本发明专利技术属于畜牧学或动物遗传育种技术领域，公开了一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法，所述MC1R基因单倍型的鉴定方法包括：通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列；基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。本发明专利技术准确鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。本发明专利技术在一个测序反应下将关键的SNPs位点同时鉴定出来；而已有技术是用2个测序引物才能将SNPs位点同时鉴定出来。相比已有技术的PCR‑RFLP鉴别方法，Sanger测序进一步提高了鉴定的准确性。

Identification and application of a haplotype of MC1R gene

【技术实现步骤摘要】
一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法
本专利技术属于畜牧学或动物遗传育种
，尤其涉及一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：在国内对有色羽活鸡的消费市场中，黑色羽毛的鸡深受消费者的喜欢，占有一定的市场份额。羽毛颜色是一个复杂性状，鸡毛色呈黑色(Extendedblack)、金翎(buttercup)和茶花色(wildtype)由E，ebc，e+三种位点分别控制，三者显隐性关系为E>ebc>e+。由于黑羽显性位点的纯合基因型和杂合基因型的表型相同，在育种过程中，需要通过将待测个体与隐性纯合子个体进行测交试验，根据杂交后代毛色是否分离才能进行区分。而测交试验需要花费大量的人力和物力，且试验时间长。因此，对黑羽鸡育种群体进行快速、准确的基因型鉴定，是提高黑羽鸡育种进程的重要手段。MC1R作为控制鸡毛色的主效基因。国内地方鸡种MC1R基因存在大量遗传变异。利用PCR产物直接测序法，在河北柴鸡鉴定出10个新SNPs。虽然对遗传变异与毛色进行的相关分析，然而未能区分黑羽中纯合和杂合个体。现有技术一，CN201210336647.2公开一种鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计；以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段；PaeI酶切消化PCR扩增的MDH基因片段；PaeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析；MDH基因不同基因频率和基因型频率。针对上述MDH基因5′侧翼区的SNP多态性，本专利技术公开其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增，特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够快速、简单、低成本、高精确地检测其单核苷酸的多态性；能够从分子遗传学上快速的对种质资源进行分型，以便用于鸡腹脂重和产蛋数的标记辅助选择(MAS)，建立鸡种群。现有技术二，CN201811413923.4公开一种c-kit基因突变检测方法，包括如下步骤：S1、依据9、11、13和17号c-Kit外显子的DNA序列设计特异性扩增引物；S2、利用步骤S1中设计得到的特异性扩增引物进行PCR扩增9、11、13和17号c-Kit外显子的基因，并对PCR扩增产物进行酶解；S3、根据测序引物，对酶解产物进行循环扩增获取Sanger片段；S4、利用步骤S3中得到的Sanger片段利用自动化基因仪上分析据9、11、13和17号c-Kit外显子的DNA序列信息，与野生基因型比对，找出突变位点。该专利技术设计了特异性扩增引物，缩短了引物的长度，提高特异性扩增灵敏度，通过所述特异性扩增引物可以直观的看到PCR扩增的目的基因是否合格，从而决定是否进行下一步，避免浪费试剂。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术中，没有通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列，基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，造成不能准确鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。(2)黑羽鸡育种测交试验需要花费大量的人力和物力，且试验时间长。(3)国内地方鸡种MC1R基因存在大量遗传变异，未能区分黑羽中纯合和杂合个体。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法。本专利技术是这样实现的，一种MC1R基因单倍型的鉴定方法，所述MC1R基因单倍型的鉴定方法包括：步骤一，通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列。步骤二，基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，准确鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。进一步，所述步骤一具体包括：通过设计1组特异性识别鸡MC1R基因的引物，将酚-氯仿抽提法纯化的样品总DNA作为PCR检测的模板，制备20μLPCR反应体系，并按照反应程序(94℃变性/25s，60℃退火/60s，72℃延伸反应/25s，30次循环)实施PCR；用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将符合要求的PCR产物进行sanger测序。根据序列变异构建的单倍型来判定鸡毛色基因型。进一步，所述鸡毛色基因型的具体判定方法为：采集黑羽鸡群与非黑羽鸡群个体，对MC1R基因进行PCR扩增并Sanger测序，比较分析黑羽与非黑羽鸡群中SNPs位点，挑选出4个SNPs位点(c.69C>T,c.212T>C,c.274G>A,c.644A>C)利用PHASE软件构建出三种单倍型，其中单倍型H1(TCAA)对H2(TCAC)和H3(CTGA)表现为完全显性，H1控制黑羽性状。在黑羽个体中，H1H1为纯合黑羽个体，而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体。进一步，所述步骤二具体包括：通过测交获得待测个体的表型与基因型。利用黑羽个体与非黑羽个体交配，根据后代出现黑羽与非黑羽的情况，判定待测个体的基因型。随后对待测个体、非黑羽个体进行MC1R基因的遗传变异分析，基于单个变异位点基因型或多个变异位点单倍型与表型关联分析，最后分析测交所确认待测个体黑羽纯合个体和杂合个体所对应的基因型，确定黑羽纯合基因型。进一步，所述通过对MC1R基因进行PCR扩增的方法为：(1)、获取鸡血液或组织样本，进行DNA提取；鸡血(5μL)或组织(30mg)样本的基因组DNA采用天根生化科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取。或采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA。(2)、根据鸡MC1R基因设计引物进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物片段大小为1144bp；PCR扩增正向引物为5’-ATCCTTGTGCCTGGGGTG-3’，反向引物为5’-CATCCATCCATCCTCCTGTC-3’，其退火温度60℃，延伸时间1min。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成并稀释为10pmol/L的工作浓度。PCR反应体系为20μl：10μl2xTaqPCRMasterMix(含有DNA聚合酶，buffer，dNTPs等)，6.4μlddH2O，上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl。反应程序：95℃变性3min，95℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。电泳条件：2.5％EB电泳缓冲液中在180V的电压条件下电泳20min。(3)、将电泳检测后符合目的片段大小的PCR产物送公司采用Sanger测序。测序引物序列为：5’-TGAGGATGAGGTGGAAGAAGAAGG-3’。Sanger测序方法参照测序公司要求进行。(4)将Sanger测序所获得DNA序列利用SeqMan软件结合人工进行SNPs位点识别并判定每个SNPs位点的基因型。本方法中，重点关注c.69C>T(ss2727686850)、c.212T>C(ss2727686851)、c.274G>A(ss2727686852)和c.644A>C(ss2727686853)4个SNPs位点。(5)利用PHASE软件对上述4个SNPs位点构建单倍型。本方法中，上述4个SNPs位点构建成三种单倍型，其中单倍型H1(TCAA)对H2(TCAC)和H3(CTGA)表现为完全显性，H1控制黑羽性状。(6)结合已知基因型的黑羽个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种MC1R基因单倍型的鉴定方法，其特征在于，所述MC1R基因单倍型的鉴定方法包括：步骤一，通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列；步骤二，基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。

【技术特征摘要】
1.一种MC1R基因单倍型的鉴定方法，其特征在于，所述MC1R基因单倍型的鉴定方法包括：步骤一，通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列；步骤二，基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。2.如权利要求1所述的MC1R基因单倍型的鉴定方法，其特征在于，所述步骤一通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列具体包括：通过设计1组特异性识别鸡MC1R基因的引物，将酚-氯仿抽提法纯化的样品总DNA作为PCR检测的模板，制备20μLPCR反应体系，并按照反应程序实施PCR；用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将符合要求的PCR产物进行sanger测序；根据序列变异构建的单倍型来判定鸡毛色基因型。3.如权利要求2所述的MC1R基因单倍型的鉴定方法，其特征在于，所述步骤一的通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列，鸡毛色基因型的具体判定方法为：采集黑羽鸡群与非黑羽鸡群个体，对MC1R基因进行PCR扩增并Sanger测序，比较分析黑羽与非黑羽鸡群中SNPs位点，挑选出4个SNPs位点，利用PHASE软件构建出三种单倍型，其中单倍型H1对H2和H3表现为完全显性，H1控制黑羽性状；在黑羽个体中，H1H1为纯合黑羽个体，而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体。4.如权利要求1所述的MC1R基因单倍型的鉴定方法，其特征在于，所述步骤二的基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型具体包括：通过测交获得待测个体的表型与基因型；利用黑羽个体与非黑羽个体交配，根据后代出现黑羽与非黑羽的情况，判定待测个体的基因型；随后对待测个体、非黑羽个体进行MC1R基因的遗传变异分析，基于单个变异位点基因型或多个变异位点单倍型与表型关联分析，最后分析测交所确认待测个体黑羽纯合个体和杂合个体所对应的基因型，确定黑羽纯合基因型...

【专利技术属性】
技术研发人员：张龚炜，张文秀，邓永琳，吴雨徽，左福元，刘安芳，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50