检测志贺氏菌属的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法及肽核酸探针技术

本发明专利技术公开了检测志贺氏菌属的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法和肽核酸探针。涉及用于鉴定不同类型的样品中志贺氏菌属(Shigella Castellani)肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)探针的设计，该PNA探针的DNA序列如SEQ ID:1所示。将这些探针与荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术结合用于检测志贺氏菌。本发明专利技术的PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性及其良好的细胞穿透性，PNA与FISH技术的结合，使本发明专利技术的检测方法具有快速，准确和灵敏的特性，提高了鉴定的准确率。

Identification of Peptide Nucleic Acid in Shigella by in situ Fluorescence Hybridization and Peptide Nucleic Acid Probe

【技术实现步骤摘要】
检测志贺氏菌属的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法及肽核酸探针
本专利技术涉及检测与食品安全性相关联的微生物的方法，尤其涉及一种检测志贺氏菌属的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法及肽核酸探针
技术介绍
食源性致病菌是引起食源性疾病的主要因素之一，在世界食品安全领域中备受关注。WHO报告表明，全球每年发生40～60亿例食源性疾病，其中约70％是因生物源性污染食品所致。发展中国家每年约有180万人口死于食源性疾病，即使是在发达国家，每年亦有10％以上的人群感染食源性疾病。目前世界公认的能引起食源性疾病的重要致病菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157、志贺氏菌等广泛存在于奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等多种食物中，是引起食品污染的重要因素。因此，食源性致病菌的有效检测对于监控食品安全是非常重要的。志贺氏菌属(ShigellaCastellani)是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。志贺氏菌通过食品感染人类，在奶制品、水产品、鸡肉、水果、面包等食品中经常被检出。发病时若不及时救治，会危及生命。志贺氏菌自从被人们发现以来，其分离培养鉴定和常规鉴定技术已经相当成熟。然而，随着科学技术的发展，传统的细菌分离鉴定、培养及生化反应的鉴定已经远远不能够支撑对病原微生物的诊断和流行病学的研究，也远远不及现在的致病微生物检测速度快、方便、特异性高、敏感性高、低耗能。志贺氏菌属(ShigellaCastellani)的检测传统上使用培养方法进行。但是，这些方法费时费力，因此，许多分子检测方法被开发出来，包括聚合酶链式反应(PCR),基因芯片技术等。免疫学检验检验方法，如酶联免疫吸附法，SPA协同凝集法，蛋白质印迹法，环介导等温扩增技术(LAMP)等，相关的有关志贺氏菌的检测方法也报道了很多，如公开号为CN107904320A专利是利用环介导恒温扩增方法来检测志贺氏菌，但该方法需要提取待测菌的基因组DNA，且引物的设计复杂，导致该检测方法耗时。公开号为CN108660228A专利是利用荧光定量PCR技术来检测志贺氏菌，存在假阳性，且其公开的引物设计复杂。公开号为CN102424839A专利公布了多重PCR检测志贺氏菌的方法，该方法需要增菌8-24小时，且需要提取待测菌的DNA，耗时费力。公开号为CN108950037A专利公开了双重LAMP检测志贺氏菌的方法，方法繁琐，耗时。标准SN/T2754.3-2011公布的检测方法为环介导恒温(LAMP)扩增检测方法，引物设计复杂，需要提取细菌基因组DNA，耗时。肤核酸是年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酞胺键为骨架的全新的模拟物,其骨架结构单元为甘氨酸,碱基部分通过亚甲基羧基连接与主骨架的氨基N上,可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性,与DNA-DNA或RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，,因此具有很高的DNA或RNA亲和性,在无错配的情况下其结合具有高稳定性,且杂交速度快,具有良好的细胞穿透性,是核酸探针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术(FISH),与传统生化鉴定比较,PNA-FISH法可节约大量时间。基于荧光检测和形态检测的PNA-FISH结果判断方法，提高了检测的准确性，避免了假阴性，假阳性的出现。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是设计了用于检测主要食源性致病菌志贺氏菌属的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，该探针具志贺氏菌特异性。本专利技术的另一目的在于提供一种志贺氏菌属的肽核酸原位荧光鉴定方法，该方法结合FISH检测技术，开展对志贺氏菌的快速检测。为了实现上述第一个目的，本专利技术采用以下技术方案：用于检测定量志贺氏菌属的肽核酸探针，该PNA探针的DNA序列如下：5’-GATAATCTACGGCATATGGC-3’。所述的PNA探针，其能检测志贺氏菌属(ShigellaCastellani)rRNA,rDNA或rRNA的序列互补中的靶序列。所述的PNA探针其N端被连接于至少一种类型的标记物质。所述的N端标记物质选自下列之一：荧光素、生物素、地高辛。为了实现上述第二个目的，本专利技术采用以下技术方案：(1)取1-5克待检样品，并将样品置于含有5-8ml灭菌LB培养液的试管中，37℃振荡培养1小时。(2)离心收集菌体，用无菌水轻轻清洗一次，再用无菌水悬浮，制成菌悬液。(3)取8-10μl步骤(2)的菌悬液点在消毒过的载玻片上，加入5-10μl固定液涂匀。(4)将步骤(3)载玻片放入烘箱80℃烘烤20-30分钟。(5)取15-20μl的含25ng/mlPNA探针的杂交液滴加到载玻片上，55℃杂交20-30分钟。(6)杂交后用洗涤液洗涤2-3次，每次5分钟。(7)风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌形态。所述固定液包含0.04-0.06g/mL的多聚甲醛和0.08-0.1g/mL的氢氧化钠。所述杂交液包含体积百分数为2％-3％的甲酰胺，0.05-0.1g/mL的硫酸葡萄糖，10mM氯化钠，0.001-0.002g/mL聚蔗糖，5mM乙二胺四乙酸。所述洗涤液包含10mM马来酸，体积百分数为0.3-0.5％的吐温20。本专利技术的有益效果是：由于PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性，杂交快速性以及良好的细胞穿透性，使本专利技术的检测方法具有快速，准确，灵敏的特性。同时结合荧光原位杂交技术，提高了该方案的鉴定准确率。具体实施方式实施例1.PNA探针设计在NCBI的网站上(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST)选取了若干志贺氏菌属的16srRNA序列，用MegAlign软件的ClustalV算法进行排序，在排序后的变异区域设计了志贺氏菌特异性探针SC-16S-F。探针序列如下：5’-GATAATCTACGGCATATGGC-3’为了验证探针的灵敏度和特异性,用BLAST(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST)对探针进行了验证。BLAST搜索发现，所设计的探针具有很高的特异性。又将PNA探针与大亚基(23S/28S)数据库匹配检测，发现没有序列与之匹配，不会发生混淆。经过BLAST分析和软件ProbeCheck的评价，所设计的探针SC-16S-F理论上具有很高的灵敏度和特异性。与阳性对照探针BacUin一起被用于后续检测。阳性探针BacUin序列如下：5’-CTGCCTCCCGTAGGA-3’随后，合成选择的序列，并在其N端接入荧光素FAM。实施例2PNA-FISH敏感度验证选取了11株志贺氏菌标准菌株和分离菌株进行了灵敏度验证,试验方法如上所述。每次试验都同步进行阳性对照和阴性对照试验，阳性对照试验，用探针BacUin替代其他探针，而阴性探针中，用空白替代其他探针。结果显示，所有实验的志贺氏菌菌株都与阳性对照探针和探针SC-16S-F呈杂交阳性(见表1)。上述结果和预设结果一致，探针SC-16S-F能检测到自己的目标菌株，有较高的敏感度。表1PNA探针灵敏度验证实施例3PNA-FISH特异性验证选取10株具有代表性的革兰氏阴性细菌和阳性细菌菌株进行PNA-FISH特异性验证。选取菌株为肠炎沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，坂崎本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测志贺氏菌属的肽核酸探针，其特征在于：所述肽核酸探针的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.用于检测志贺氏菌属的肽核酸探针，其特征在于：所述肽核酸探针的DNA序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的肽核酸探针，其特征在于，其能检测志贺氏菌属(ShigellaCastellani)rRNA、rDNA或rRNA的序列互补中的靶序列。3.根据权利要求1或2所述的肽核酸，其特征在于，其N端被连接于至少一种类型的标记物质。4.根据权利要求3所述的肽核酸，其特征在于，N端标记物质选自下列之一：荧光素、生物素、地高辛。5.用于检测志贺氏菌(ShigellaCastellani)的方法，其特征在于，其使用权利要求1-4任一项所述的肽核酸探针，且其包括以下步骤：(1)取1-5克待检样品，并将样品置于含有5-8ml灭菌LB培养液的试管中，37℃振荡培养1小时；(2)离心收集菌体，用无菌水清洗一次，再用无菌水悬浮，制成菌悬液；(3)取8-10μl步骤(2)的菌悬液点在消毒过的载玻片上，加入5-10μl固定液涂匀；(4)将步骤(3)载玻...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光富，俞晓平，张蓬军，申屠旭萍，郝培应，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33