加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及病原微生物的检测技术领域，尤其涉及加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法。所述试剂盒中包含GD/CA保守区域特异的引物对和Taqman荧光探针，该试剂盒通过实时荧光定量PCR，能准确地将GD/CA感染样本检测出来，灵敏度高、特异性好、重复性强，且使用方便快捷。

Primers, probes, kits and detection methods for double detection of Gardnerella and Candida albicans

【技术实现步骤摘要】
加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及病原微生物的检测
，尤其涉及加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
阴道炎(vaginitis)即阴道炎症，是导致外阴阴道症状如瘙痒、灼痛、刺激和异常流液的一组病症。正常情况下有需氧菌及厌氧菌寄居在阴道内，形成正常的阴道菌群。任何原因将阴道与菌群之间的生态平衡打破，也可形成条件致病菌。临床上常见有：细菌性阴道病(占有症状女性22％～50％)、念珠菌性阴道炎(17％～39％)、滴虫性阴道炎(4％～35％)、老年性阴道炎、幼女性阴道炎。对阴道炎的病原物进行有效鉴别和诊断，对于阴道炎的对症治疗至关重要。细菌性阴道病(Bacterialvaginosis，BV)的最主要病原体是阴道加德纳杆菌(Gardnerellavaginalis，GD)，可经性接触传播。加德纳杆菌为革兰氏阴性细小杆菌，常呈球杆状，有时呈丝状和多形状，常见两极染色。宽0.4--0.6微米，长1--2微米大小，无活动力、无鞭毛、无芽孢。许多菌株有荚膜。加德纳杆菌引起的感染多数较轻，多见于性活跃妇女。急性期白带增多，有鱼腥或氨的臭味，外阴潮湿不适，常伴有阴道灼热感、性交痛及外阴骚痒。检查见部分患者外阴红肿，阴道粘膜充血，呈灰红色，轻度红肿，分泌物多呈均质性，稀薄，灰白色，有时为乳黄色或类绿色，腥臭味。阴道pH常为5--5.5。有时白带量少，仅有薄薄一层，如膜样覆盖在充血的阴道壁上。少数患者阴道壁有红斑或淤点，孕妇患者可引起流产或产后子宫内膜炎。感染重者也可导致败血症、尿道感染、肾周脓肿和膀胱炎等。念珠菌性阴道炎最常见的是白色念珠菌(CanidiaAlbicans，CA)，此菌呈卵圆形，有芽孢及细胞发芽伸长而形成的假菌丝。念珠菌对热的抵抗力不强，加热至60℃1小时后即可死亡，但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强。念珠菌感染最常见的症状是白带多，外阴及阴道灼热瘙痒，外因性排尿困难，外阴地图样红斑(霉菌性或念珠菌性外阴阴道炎)。典型的白带呈凝乳状或为片块状，阴道粘膜高度红肿，可见白色鹅口疮样斑块附着，易剥离，其下为受损粘膜的糜烂基底，或形成浅溃疡，严重者可遗留瘀斑。但白带并不都具有上述典型特征，从水样直至凝乳样白带均可出现，如有的完全是一些稀薄清沏的浆液性渗出液，其中常含有白色片状物。妊娠期霉菌性阴道炎的瘙痒症状尤为严重，甚至坐卧不宁，痛苦异常，也可有尿频、尿痛及性交痛等症状。另外，尚有10％左右的妇女及30％孕妇虽为霉菌携带者，却无任何临床表现。目前，加德纳杆菌(GD)、白色念珠菌(CA)性阴道炎(简称为GD/CA)的检测方法主要有分离培养、阴道炎五项/七项、和分子生物学诊断，三种方法具有以下特点：1)病原体的分离培养是GD/CA的金标准，但分离培养法对技术要求较高，费用较昂贵，耗时长，在临床检测中应用不多。2)阴道炎五项-七项，是目前临床检测应用较多的实验室方法，主要检测阴道炎引起的相关指标变化，包括过氧化氢酶、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、脯氨酸氨基肽酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、氧化酶、PH值。但这些指标均为间接检测，具备不确切性。3)病原体核酸检测：具有快速、准确、检测窗口短、高灵敏度等优点，能够对GD/CA作出早期诊断，给病情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中实时定量PCR检测平台已成为最简捷和可靠的核酸检测方法，在目前国内外的核酸诊断中应用最为广泛，检测原理为，检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光，引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比，可实时监控扩增情况。目前，国内针对白色念珠菌的荧光定量PCR检测的专利较多；公开号为CN102719529B的专利公开了阴道毛滴虫和白色念珠菌双通道荧光PCR检测方法及其试剂盒，是针对阴道毛滴虫和白色念珠菌的两重检测；而针对加德纳杆菌的荧光定量PCR检测极少，更没有针对GD/CA联合检测的荧光定量PCR试剂盒产品。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法，该引物、探针组所针对的靶基因片段较小，特异性较强，且灵敏度较高。本专利技术提供的加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组，其包括：SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针；和SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的引物对，SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针。本专利技术选择加德纳杆菌16SrRNA保守区域，白色念珠菌ITS保守区域、β-珠蛋白基因(HBB，内标)保守区域，设计特异性引物和探针，利用实时荧光定量PCR技术，制成GD/CA实时荧光定量PCR检测试剂盒，并介绍了其使用方法。本专利技术中，SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针针对加德纳杆菌(GD)的16SsRNA设计，所述GD特异性靶基因片段长度为127bp；序列为：CGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCA(SEQIDNO:10)。本专利技术中，SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的引物对，SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针针对白色念珠菌(CA)的ITS设计，所述CA特异性靶基因片段长度为133bp；序列为：AACAAACTTGCTTTGGCGGTGGGCCCAGCCTGCCGCCAGAGGTCTAAACTTACAACCAATTTTTTATCAACTTGTCACACCAGATTATTACTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCA(SEQIDNO：11)。本专利技术所述的引物和探针具有良好的准确性、灵敏度、特异性，即便在同一个扩增体系中进行检测，也能够良好的区分GD或CA。本试剂盒对GD、CA的最低检出限浓度均为1.0×100拷贝/μL，即最低检出限为5拷贝。本专利技术中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。具体的，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。本专利技术还提供了加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的试剂盒，其包括本专利技术所述的引物、探针组。本专利技术提供的试剂盒中，还包括对内参基因HBB检测的引物对和探针；所述针对内参基因HBB检测的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:7～8所示；所述针对内参基因HBB检测的探针的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。所述HBB特异性靶基因片段序列为：TCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组，其包括：SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；和SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针。

【技术特征摘要】
1.加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组，其包括：SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针；和SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的引物对，SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针。2.根据权利要求1所述的引物、探针组，其特征在于，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。3.加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的试剂盒，其包括权利要求1或2所述的引物、探针组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括对内参基因HBB检测的引物对和探针；所述针对内参基因HBB检测的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:7～8所示；所述针对内参基因HBB检测的探针的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，SEQIDNO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹国宝，郭光华，蔺皓，魏颖颖，刘欣欣，宋高尚，沈江卫，吴茜，
申请(专利权)人：中生方政生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32