检测枯草芽孢杆菌NCD‑2菌株的特异性引物及应用。本发明专利技术涉及特异性检测枯草芽孢杆菌NCD‑2菌株的引物。本发明专利技术所述特异性引物包括上游引物qNCD‑ORF7‑F和下游引物qNCD‑ORF7‑R，qNCD‑ORF7‑F的核苷酸序列为5’‑AGGCAGCATTCAAGCACCAG‑3’，qNCD‑ORF7‑R的核苷酸序列为5’‑AGCCAGCGATCATTCCCATC‑3’，利用所述引物能够从NCD‑2菌株扩增出片段单一的目的片段，但在其他细菌中均没有扩增信号，从而利用所述引物实现了NCD‑2菌株的特异性检测。本发明专利技术还提供一种包含本发明专利技术引物的用于检测枯草芽孢杆菌NCD‑2菌株的检测试剂盒。本发明专利技术所述引物和试剂盒具有特异性高、检测效率高、假阴性率低、保存时间长等特点。
Specific primers for detection of Bacillus subtilis NCD-2 strain and their application
【技术实现步骤摘要】
检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物及应用
本专利技术属于基因检测
，尤其涉及一种检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物及应用。
技术介绍
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，生长和繁殖速度较快，所形成的芽孢具有耐逆、抗热的优点。另外，枯草芽孢杆菌菌体生长过程中会产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对植物病原菌有明显的抑制作用。因此，枯草芽孢杆菌成为开发微生物杀菌剂的重要资源。枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到防治植物病害的目的。中国专利文献CN1528885A公开了一种防治棉花黄萎病的菌株及其菌剂的制备方法，其中公开了枯草芽孢杆菌NCD-2菌株能有效地防治棉花黄萎病。以枯草芽孢杆菌NCD-2菌株为主要活性成份的微生物农药目前已经商品化。为加强对NCD-2菌株的保护，以及快速识别NCD-2菌株，建立枯草芽孢杆菌NCD-2菌株特异性检测技术尤为重要。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的引物。本专利技术人通过转座子随机插入突变技术，构建了枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的突变子库，筛选获得一株生物膜形成能力降低的突变子。通过巢式PCR技术克隆获得突变子中转座子插入位点基因。通过在NCBI数据库中进行序列比对，世界范围内没有发现与NCD-2菌株同源性较高的菌株，因此根据NCD-2菌株中该基因片段设计出针对NCD-2菌株的特异性引物。本专利技术所述特异性引物包括上游引物qNCD-ORF7-F和下游引物qNCD-ORF7-R，利用该引物可以从NCD-2菌株扩增出片段单一的目的片段，但在其他细菌中均没有扩增信号，实现了NCD-2菌株的特异性检测。本专利技术所采用的技术方案为：一种用于检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物，其特征在于，所述引物包括上游引物qNCD-ORF7-F和下游引物qNCD-ORF7-R；所述qNCD-ORF7-F的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：5’-AGGCAGCATTCAAGCACCAG-3’；所述qNCD-ORF7-R的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示：5’-AGCCAGCGATCATTCCCATC-3’。一种用于特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒，其包含DNA裂解液、扩增反应液、引物混合液和阳性对照液，所述引物混合液包括如权利要求1所述的特异性引物。进一步地，所述DNA裂解液包括100mMNaCl、pH值为8.0的10mMTris-Cl、pH值为8.0的25mMEDTA、1％W/V的十二烷基硫酸钠和1.7μg/μL蛋白酶K；所述扩增反应液包括PCR缓冲液、25mMMgCl2溶液和2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液。进一步地，所述引物混合液包括100pmol/μL的qNCD-ORF7-F和100pmol/μL的qNCD-ORF7-R；所述阳性对照液包含枯草芽孢杆菌NCD-2菌株DNA，浓度为200pmol/μL特异性引物在制备用于检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒中的应用。特异性引物在检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株中的应用。一种定性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品中的基因组DNA；(2)PCR扩增：以基因组DNA为模板，以qNCD-ORF7-F和qNCD-ORF7-R为引物进行PCR扩增；(3)PCR产物观察：取扩增产物进行电泳，电泳结束后进行染色，随后进行PCR产物观察。进一步地，步骤(2)中，PCR反应体系为：含Mg2+的缓冲液5μL、脱氧核糖核苷酸8μL、引物qNCD-ORF7-F1μL、引物qNCD-ORF7-R1μL、基因组DNA1μL、rTaqDNA聚合酶1μL，双蒸水33μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环，72℃链延伸10min。进一步地，步骤(3)中，所述电泳电压为90-110V，所述电泳时间为35-45min，进行所述染色的染料为GoldView染料，所述染色时间为25-35min。一种定量检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的方法，包括以下步骤：(S1)提取待测样品中的基因组DNA；(S2)实时定量PCR扩增：以基因组DNA为模板，以qNCD-ORF7-F和qNCD-ORF7-R为引物进行实时定量PCR扩增；(S3)根据扩增结果，对枯草芽孢杆菌NCD-2菌株进行定量。进一步地，步骤(S2)中，实时定量PCR反应体系为：KODSYBRqPCRMix10μL、浓度为10μM的qNCD-ORF7-F0.4μL、浓度为10μM的qNCD-ORF7-R0.4μL、50×ROX参比染料0.4μL、基因组DNA2μL、双蒸水6.8μL；PCR反应条件为：98℃2min，98℃10s、60℃10s、68℃30s、40个循环。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述特异性引物包括上游引物qNCD-ORF7-F和下游引物qNCD-ORF7-R，qNCD-ORF7-F的核苷酸序列为5’-AGGCAGCATTCAAGCACCAG-3’，qNCD-ORF7-R的核苷酸序列为5’-AGCCAGCGATCATTCCCATC-3’，利用所述引物能够从NCD-2菌株扩增出片段单一的目的片段，但在其他细菌中均没有扩增信号，从而利用所述引物实现了NCD-2菌株的特异性检测。本专利技术还提供一种包含本专利技术引物的用于检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的检测试剂盒。本专利技术所述引物和试剂盒具有特异性高、检测效率高、假阴性率低、保存时间长等特点。利用该引物，通过实时定量PCR技术快速定量NCD-2菌株在土壤中的群体数量，具有高通量、快速和准确的优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术引物扩增多种细菌来源的基因组DNA所得产物的电泳检测图；图2是本专利技术引物扩增多种细菌来源的基因组DNA所得溶解曲线；图3是NCD-2菌株基因组DNA和土壤总DNA混入NCD-2基因组DNA扩增后的标准曲线；图4是本专利技术所述定量方法与传统菌落计数法的对比图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。实施例1本专利技术提供一种用于检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物，所述引物包括上游引物qNCD-ORF7-F和下游引物qNCD-ORF7-R，所述qNCD-ORF7-F的核苷酸序列为：5’-AGGCAGCATTCAAGCACCAG-3’，所述qNCD-ORF7-R的核苷酸序列为5’-AGCCAGCGATCATTCCCATC-3’。本专利技术提供一种定性检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测枯草芽孢杆菌NCD‑2菌株的特异性引物，其特征在于，所述引物包括上游引物qNCD‑ORF7‑F和下游引物qNCD‑ORF7‑R；所述qNCD‑ORF7‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：5’‑AGGCAGCATTCAAGCACCAG‑3’；所述qNCD‑ORF7‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：5’‑AGCCAGCGATCATTCCCATC‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物，其特征在于，所述引物包括上游引物qNCD-ORF7-F和下游引物qNCD-ORF7-R；所述qNCD-ORF7-F的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：5’-AGGCAGCATTCAAGCACCAG-3’；所述qNCD-ORF7-R的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示：5’-AGCCAGCGATCATTCCCATC-3’。2.一种特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含DNA裂解液、扩增反应液、引物混合液和阳性对照液，所述引物混合液包括如权利要求1所述的特异性引物。3.根据权利要求2所述的特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒，其特征在于，所述DNA裂解液包括100mMNaCl、pH值为8.0的10mMTris-HCl、pH值为8.0的25mMEDTA、1％W/V的十二烷基硫酸钠和1.7μg/μL蛋白酶K；所述扩增反应液包括PCR缓冲液、25mMMgCl2溶液和2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液。4.根据权利要求2所述的特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒，其特征在于，所述引物混合液包括100pmol/μL的qNCD-ORF7-F和100pmol/μL的qNCD-ORF7-R；所述阳性对照液包含枯草芽孢杆菌NCD-2菌株DNA，浓度为200pmol/μL。5.一种如权利要求1所述的特异性引物在制备用于检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒中的应用。6.一种如权利要求1所述的特异性引物在检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株中的应用。7.一种定性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样品中的基因组DNA；(2)PCR扩增：...
【专利技术属性】
技术研发人员：马平，郭庆港，李社增，王培培，鹿秀云，张晓云，赵卫松，苏振贺，
申请(专利权)人：河北省农林科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13
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