一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法。属于生物技术工程领域，具体涉及利用λ‑Red重组酶方法，对编码大肠杆菌趋氧性受体基因aer进行敲除，使之丧失趋氧性，构建一个大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失菌株模型。用于研究细菌的侵染过程，治理病害；为治理环境污染，净化污水提供理论依据。

A strain of Escherichia coli with loss of aer function of oxygenator gene and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法
本专利技术属于生物技术工程领域，具体涉及通过大肠杆菌aer基因被敲除而丧失趋氧受体基因，致使该菌丧失对氧气的趋化性功能。
技术介绍
趋化性是细菌调控对外界环境做出适应性反应的感受系统之一，有运动能力的细菌对浓度不同的化学物质做出反应，使之趋向有利的环境，或逃避有害与不利的环境。趋氧性(或者能量趋性)是趋化性的一种，是一种能引导细菌自动定位并移动于某处，从而使它们可以达到最佳胞内氧水平。这种趋氧性是通过呼吸链完成的，由此可见趋氧性传感器对各类细菌的生命活动极为重要。运动型细菌大多具有这种趋氧性，并且趋氧性在细菌的生命周期中具有重要的生物学功能。大肠杆菌中编码趋氧性受体基因是aer。研究细菌的趋化性，构建大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失模型，对研究控制细菌的侵染过程，治理病害；治理环境污染，净化污水；以及研究治疗癌症等疾病都有重要意义。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株，利用λ-Red重组酶方法，对编码大肠杆菌趋氧性受体基因aer进行敲除，使之丧失趋氧性，构建一个大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失菌株模型。用于研究细菌的侵染过程，治理病害；为治理环境污染，净化污水提供理论依据。本专利技术的另一目的是提供制备上述大肠杆菌菌株的方法。为了实现上述目的本专利技术采用如下技术方案：第一方面，提供一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株的制备方法，包括以下步骤：(1)设计引物：用于同源重组的引物为Aer-tet-R和Aer-tet-F；设计原则是5'端为aer基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列(加下划线)，重组体的检测所用引物为JC-Aer-R及JC-Aer-F，这些引物的序列如下所示：Aer-tet-R:ATCAGGCATTGTGCTCCAACCGCCCGGATCCGGCATACCGACTAAGCACTTGTCTCCTG；Aer-tet-F:CAAGAAGTTAACAACCATATAACCTGCACAGGACGCGAACTTAAGACCCACTTTCACA；JC-Aer-R:AAGATGCGCCAGCATCGC；JC-Aer-F:GGCCGACATAAACTCTGA；(2)含tetRA基因的DNA片段的扩增：以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac(Tet+，Kan+，购自武汉淼灵生物科技有限公司)的DNA为模板，Aer-tet-R和Aer-tet-F为引物进行PCR扩增，获得两端分别与aer基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetRA的DNA片段。将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化。(3)感受态细胞的制备：将含有pKD46质粒的MG1655菌株在含有20μg/mLAmp的LB培养基中30℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20μg/mLAmp的LB中30℃下震荡培养，当OD600达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用。(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定将胶回收的DNA片段(100ng)与80μL感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10min后，用2200V电击，电击后迅速加入1000μLLB培养液，30℃下震荡培养30min后在20μg/mL的四环素平板上涂板，37℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用JC-Aer-R及JC-Aer-F引物对这些菌落进行菌落PCR鉴定，有四环素抗性基因tetRA的DNA片段的菌落即为大肠杆菌基因aer敲除的菌株。获得大肠杆菌趋氧受体基因aer敲除菌株，还可以通过部分敲除aer基因或在aer基因中插入外源DNA片段来实现。部分敲除aer基因引物设计原则是先确定要敲除的序列，引物的5'端为待敲除序列相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列；插入外源DNA序列使aer基因失活的引物设计原则是先确定插入外源DNA的位置，引物的5'端为待插入位置相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列。用来敲除、替换或插入的基因片段，出来可以选用四环素抗性基因tetRA的DNA片段外，还可以选择其它抗性基因片段，如氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、甲氧西林抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因等抗性基因；或者其它便于筛选的标记基因如绿色/红色荧光蛋白基因等。第二方面，提供上述制备方法获得的趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株。本专利技术相对于现有技术的优势在于：构建大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失模型，用于研究细菌的侵染过程，治理病害；为治理环境污染，净化污水提供理论依据。附图说明图1PCR产物切胶回收电泳检测；M：DL2000DNA标样；1：四环素抗性基因胶回收产物。图2菌落PCR鉴定图；M：DL2000DNA标样；1-4：实验组；5对照。图3A为MG1655菌株在泳动培养基上培养结果；图3B为aer基因缺失突变株在泳动培养基上培养结果；具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。【实施例1】利用λ-Red重组酶方法对编码大肠杆菌趋氧受体基因aer进行敲除(1)设计引物：用于同源重组的引物为Aer-tet-R和Aer-tet-F，设计原则是5'端为aer基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列(加下划线)，重组体的检测所用引物为JC-Aer-R及JC-Aer-F。这些引物的序列如表1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表1本专利技术所用的引物(2)含tetRA基因的DNA片段的扩增：以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac的DNA为模板，Aer-tet-R和Aer-tet-F为引物进行PCR扩增，获得两端分别与aer基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetRA的DNA片段。将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化，如图1所示。(3)感受态细胞的制备：将含有pKD46质粒的MG1655菌株在含有20μg/mLAmp的LB培养基中30℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20μg/mLAmp的LB中30℃下震荡培养，当OD600达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用。(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定将胶回收的DNA片段(100ng)与80μL感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10min后，用2200V电击，电击后迅速加入1000μLLB培养液，30℃下震荡培养30min后在20μg/mL的四环素平板上涂板，37℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用JC-Aer-R及JC-Aer-F引物对这些菌落进行菌落PCR鉴定，有四环素抗性基因tetRA的DNA片段的菌落即为大肠杆菌基因aer敲除的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种趋氧受体基因

【技术特征摘要】
1.一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计引物：用于同源重组的引物为Aer-tet-R和Aer-tet-F;设计原则是5'端为aer基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列（加下划线），重组体的检测所用引物为JC-Aer-R及JC-Aer-F，这些引物的序列如下所示：Aer-tet-R:ATCAGGCATTGTGCTCCAACCGCCCGGATCCGGCATACCGACTAAGCACTTGTCTCCTG；Aer-tet-F:CAAGAAGTTAACAACCATATAACCTGCACAGGACGCGAACTTAAGACCCACTTTCACA；JC-Aer-R:AAGATGCGCCAGCATCGC；JC-Aer-F:GGCCGACATAAACTCTGA；（2）含tetRA基因的DNA片段的扩增：以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac（Tet+，Kan+，购自武汉淼灵生物科技有限公司）的DNA为模板，Aer-tet-R和Aer-tet-F为引物进行PCR扩增，获得两端分别与aer基因上、下游同源，中间为四...

【专利技术属性】
技术研发人员：江楠，王松太，郭书奎，杨雪，
申请(专利权)人：武汉生物工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42