β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种β‑丙氨酸生产菌及其制备方法和用途，所述β‑丙氨酸生产菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC NO：17830。本发明专利技术所构建的β‑丙氨酸生产菌在发酵过程中不需要添加天冬氨酸，就能够实现发酵过程中发酵液中β‑丙氨酸的有效积累，提高了β‑丙氨酸的产量及糖转化率，β‑丙氨酸的产量高达50g/L，糖酸转化率达40%，具有大规模生产的应用潜力。

Producing bacteria of beta-alanine and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种β-丙氨酸基因工程生产菌。
技术介绍
β-丙氨酸是迄今为止在自然界中发现的唯一种β-氨基酸。它是一种天然的非蛋白氨基酸，在生物体内是泛酸的重要前体。β-丙氨酸及其衍生物广泛应用于医药、食品、化工等行业。在医药应用中，它是许多b族维生素药物中的中间体。在化学工业中可用于电镀缓蚀剂的制备.由于能够增强肌肉耐力的能力，β-丙氨酸经常被补充到一些功能饮料中。β-丙氨酸的主要生产方法有化学法、酶法和发酵法。化学法包括丙烯腈法、β-氨基丙腈法、琥珀酰亚胺降解法等，但由于成本高、工艺条件苛刻、副产物多、生产环境不友好等缺点，其市场竞争力逐渐丧失。为了避免化学方法的缺点，人们在酶法方面做出了很大的努力。其中，L-天冬氨酸α脱羧酶(ADC)，因其具有催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸的能力，正成为研究的热点。大量的研究发现，一些ADC具有较高的转化率。在此基础上，β-丙氨酸的生产取得了很大进展。然而，由于受到酶活性、产物浓度、转化率、生产周期长等因素的影响，主要是由于该方法需要添加昂贵的天冬氨酸前体，酶法的大规模的工业化应用受到了很大的限制。葡萄糖等可再生原料被认为是降低生产成本的最有效途径。因此利用全细胞生物催化生产氨基酸因其成本低、操作方便而受到越来越多的关注。最近的许多研究都发现，该方法能有效地生产氨基酸。最近的一项研究报道，在一株产富马酸的工程菌中过量表达ADC，获得的工程菌能够以葡萄糖为原料生产β-丙氨酸，其产量达到32.3g/L。然而该菌株由于利用质粒转化，因此需要加入相应的抗生素，否则容易引起质粒丢失。这在一定程度上增加了生产的成本，限制了产品的应用。因此，获得无需添加合成前体和抗生素的生产菌株是β-丙氨酸生产的目标，这样通过直接发酵就可以获得高产率的β-丙氨酸，大大降低生产成本。
技术实现思路
为了克服现有β-丙氨酸生产技术上的缺陷，得到高效的β-丙氨酸发酵菌株，本专利技术利用基因工程技术改造大肠杆菌，依据设计合理的代谢途径，通过增强合成途径中关键基因的表达，阻断分支代谢途径，获得一株β-丙氨酸的生产菌株。利用该菌株，在发酵生产β-丙氨酸的过程中，不需要添加前体天冬氨酸，利用葡萄糖为原料，就能高效生产β-丙氨酸，该方法有效地降低了生产成本，具有大规模生产β-丙氨酸的应用潜力。因此，本专利技术的目的之一在于提供一种β-丙氨酸生产菌。本专利技术的目的之二在于提供一种β-丙氨酸生产菌的构建方法。本专利技术的目的之三在于提供所述β-丙氨酸生产菌用于生产β-丙氨酸的应用。本专利技术的技术解决方案是：一种β-丙氨酸生产菌(Escherichiacoli)，其特征是:保藏编号为CGMCCNO：17830。分类命名：大肠埃希氏菌，拉丁文学名：Escherichiacoli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2019年5月20日。该β-丙氨酸生产菌是通过以下步骤的方法构建出来的：A.敲除原始菌株中的基因ldhA、ilvBN、pta、adhE、akI、akIII、gdh获得基因敲除菌株；B.增强在步骤A中所述基因敲除菌株中的基因PEPC和AspA，使这些基因表达量增加，获得基因增强菌株；C.在步骤B中所述的基因增强菌株中引入外源基因ADC、AspDH和PC，获得的β-丙氨酸的生产菌。根据本专利技术目的，提供上述β-丙氨酸生产菌在生产中的应用。在上述应用中，利用上述基因工程生产菌直接发酵生产β-丙氨酸，无需在培养基或发酵液中添加β-丙氨酸的合成前体。在优选的实施方式中，培养基或发酵液中不添加天冬氨酸。根据本专利技术的优选实施例，发酵培养基组成如下：葡萄糖2％、NaCl0.08％,硫酸铵0.3％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉2％、KH2PO41.25％、MgSO40.1％、柠檬酸0.15％，pH7.0。本专利技术所构建的β-丙氨酸生产菌在发酵过程中不需要添加天冬氨酸，就能够实现发酵过程中发酵液中β-丙氨酸的有效积累，提高了β-丙氨酸的产量及糖转化率，β-丙氨酸的产量高达50g/L，糖酸转化率达40％，具有大规模生产的应用潜力。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。本专利技术中涉及的基因名称解释如下：ldhA：乳酸脱氢酶ilvBN：乙酰羟酸合成酶pta：磷酸转乙酰酶adhE：乙醇脱氢酶akI：天冬氨酸激酶Igdh：谷氨酸脱氢酶PEPC：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶AspA：天冬氨酸酶ADC：天冬氨酸脱羧酶AspDH：天冬氨酸脱氢酶PC：丙酮酸羧化酶本专利技术在设计基因工程菌的构建方案中，根据大肠杆菌中β-丙氨酸的代谢途径，在大肠杆菌W3110构建了一系列突变体，如基因ldhA、ilvBN、pta、adhE、akI、akIII、gdh等的敲除，内源基因PEPC和AspA的过表达，外源基因如ADC、AspDH和PC的插入。其中ldhA的敲除阻断了丙酮酸生产D-乳酸途径，ilvBN的敲除阻断了丙酮酸生产乙酰羟酸途径，pta的敲除阻断了乙酰辅酶A生产磷酸乙酰进而合成乙酸的途径。adhE的敲除阻断了乙酰辅酶A生成乙醇的途径，gdh的敲除阻断了α-酮戊二酸生成谷氨酸的途径，akI、akIII的敲除阻断了天冬氨酸的分支代谢；大肠杆菌内源基因PEPC和AspA通过启动子代换的方式增强表达，PEPC的增强表达增加了反应前体物草酰乙酸生产的产生，AspA的增强表达增加了反应前体物天冬氨酸的产生；外源高活性基因引入到工程菌的染色体中，ADC的引入直接催化天冬氨酸生成β-丙氨酸，PC的引入增加了反应前体物草酰乙酸生产的产生，AspDH的引入增加了反应前体物天冬氨酸的产生。最后获得β-丙氨酸生产的基因工程菌ZF008。大肠杆菌β-丙氨酸的生产工程菌ZF009(保藏编号为CGMCCNO：17830。分类命名：大肠埃希氏菌，拉丁文学名：Escherichiacoli，)的构建方法，参考PoteeteAR和FentonAC报道的文献(Geneticrequirementsofphagelambdared-mediatedgenereplacementinEscherichiacoliK-12.JBacteriol，2000，182(8):2336-2340)进行大肠杆菌基因组中基因的敲除、启动子代换、外源基因插入。实施例以下实施例中，所述卡那霉素的使用终浓度为50ng/μL。所述氨苄青霉素的使用终浓度为100ng/μL。所述氯霉素的使用终浓度为35ng/μL。以下实施例中使用的引物序列信息表如表1所示。实施例1：pET28a(+)的启动子突变体pET28am的制备本实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公司。测序反应在华大公司测序，但不局限于此公司。(1)PCR扩增：以PpET28am-F/PpET28am-R为引物，以质粒pET28a(+)为模板，PCR扩增获得pET28am片段，约5300bp，胶回收。(2)重组反应：利用DpnI对胶回收片段进行处理，消除可能混入的原pET28a(+)质粒，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β‑丙氨酸生产菌(

【技术特征摘要】
1.一种β-丙氨酸生产菌(Escherichiacoli)，其特征是：保藏编号为CGMCCNO：17830。2.一种权利要求1所述的β-丙氨酸生产菌的制备方法，其特征是：依次包括以下步骤：A.敲除作为原始菌株的大肠杆菌W3110中的基因ldhA、ilvBN、pta、adhE、gdh,获得基因敲除菌株；B.增强步骤A中所述基因敲除菌株中的基因PEPC、AspA；C.将外源基因ADC、PC和AspDH插入到步骤B中所述菌株的染色体中，获得β-丙氨酸生产菌。3.一种β...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，冯志彬，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37