一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种表达D‑苏氨酸醛缩酶的重组菌及其构建方法与应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术的重组菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D‑苏氨酸醛缩酶。本发明专利技术提供了一种D‑苏氨酸醛缩酶可作为催化剂应用于手性β‑羟基‑α‑氨基酸的合成，其催化效率高(转化率>65％)、立体选择性强(e.e.>99％，d.e.>95％)、适用的反应条件温和、环境友好。本发明专利技术的D‑苏氨酸醛缩酶催化效果佳，底物适用性广，具有很好的应用开发前景。

A recombinant strain expressing D-threonine aldolase and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌及其构建方法与应用，属于酶工程

技术介绍
手性β-羟基-α-氨基酸是一类非常重要的化合物，因其具有手性羟基和氨基酸两个官能团，在医药、材料等精细化学品的制造中具有非常广泛的应用。化学法合成手性β-羟基-α-氨基酸具有催化剂昂贵、重金属污染、合成路线较长以及在较为苛刻的条件下才能提高产物的立体选择性等缺点，不利于工业生产的放大。与化学法相比，酶法不需要任何保护基，具有更好的立体选择性，反应可以一步完成等优点。因此，酶法合成β-羟基-α-氨基酸更具有应用开发的潜力。苏氨酸醛缩酶是一类磷酸吡哆醛依赖型的醛缩酶，是有机合成中碳-碳键形成的强有力工具，它可以催化带有不同取代基的醛和甘氨酸发生特异的羟醛缩合反应生产出高附价值的β-羟基-α-氨基酸，在形成的两个手性中心的α-碳具有高度的选择性，而β-碳的立体选择性较差。因此，开发高效、高立体选择性的苏氨酸醛缩酶，对于合成甲砜霉素、氟苯尼考等药物的手性中间体(l-syn-对甲砜基苯丝氨酸)的技术转型升级具有重要意义。目前，对于l-syn-对甲砜基苯丝氨酸的酶法生产，大多是通过酶法拆分dl-syn-对甲砜基苯丝氨酸获得。其中，在两相体系下(二氯甲烷、二氯乙烷、环已酮)，来源于Delftiasp.RIT313的D-苏氨酸醛缩酶能够完全拆分300mmol·L-1dl-syn-对甲砜基苯丝氨酸，是目前最高底物浓度(CatalysisScience&Technology,2017,7,5964-5973)。然而，酶法合成l-syn-对甲砜基苯丝氨酸的研究报道较少。来源于P.putida的l-苏氨酸醛缩酶催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸合成l-syn-对甲砜基苯丝氨酸产率为68％，d.e.值仅为53％(Tetrahedron,2007,63,918-926)。较低的酶活和立体选择性一直以来都是制约苏氨酸醛缩酶应用的瓶颈，急需开发新型的具备高活性和高立体选择性的苏氨酸醛缩酶来满足工业化应用的要求。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌，生产的D-苏氨酸醛缩酶可高效催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸合成l-syn-对甲砜基苯丝氨酸，产率为65％以上，d.e.值为95％以上。该过程具有条件温和、操作简单等优点。本专利技术的第一个目的是提供一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌，所述重组菌表达了氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-苏氨酸醛缩酶。进一步地，所述的重组菌是以是细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞为宿主细胞。进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌为宿主菌。优选大肠杆菌BL21(DE3)。进一步地，所述的重组菌的表达载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。进一步地，所述的重组菌的表达载体为pET系列表达载体。优选pET28a。本专利技术的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，包括如下步骤：(1)构建重组质粒pET28a-ApDTA：将D-苏氨酸醛缩酶基因ApDTA与酶切过的质粒pET28a进行连接，得到重组表达载体pET28a-ApDTA；(2)构建重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-ApDTA：将构建好的重组表达载体pET28a-ApDTA热转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，培养筛选得到重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-ApDTA。本专利技术的第三个目的是提供所述重组菌在手性β-羟基-α-氨基酸的合成中的应用。进一步地，所述应用是利用所述的重组菌发酵生产的D-苏氨酸醛缩酶作为催化剂，合成手性β-羟基-α-氨基酸。进一步地，所述应用具体是催化醛和甘氨酸合成手性β-羟基-α-芳基氨基酸。进一步地，所述的催化在反应温度为5～15℃，pH为5.5～6.5的条件下反应10～20h。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种D-苏氨酸醛缩酶可作为催化剂应用于手性β-羟基-α-氨基酸的合成，其催化效率高(转化率>65％)、立体选择性强(e.e.>99％,d.e.>95％)、适用的反应条件温和、环境友好。本专利技术的D-苏氨酸醛缩酶催化效果佳，底物适用性广，具有很好的应用开发前景。附图说明图1为基因ApDTA的PCR扩增电泳图谱；M，Marker；1，基因ApDTA；图2为pET28a-ApDTA重组质粒物理图谱；图3为重组d-苏氨酸醛缩酶的蛋白电泳图；M，Marker；泳道1、2、3分别为重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-ApDTA诱导后上清、沉淀及纯化后的酶；图4为d-苏氨酸醛缩酶催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸缩合为对甲砜基苯丝氨酸的反应式；图5反应液产物l-syn-对甲砜基苯丝氨酸的HPLC图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。D-苏氨酸醛缩酶催化反应产物HPLC分析条件为：色谱柱DiamonsilPlusC18(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为V(CH3CN):V(50mmol·L-1磷酸二氢钾溶液)＝15:85，流速为0.2～1mL·min-1，检测波长为338nm，柱温为40℃，OPA-NAC柱前衍生化液相测定。同时以l-syn-对甲砜基苯丝氨酸标准品做对照，确定产物出峰时间和次序，并以此为依据进行酶活力测定。D-苏氨酸醛缩酶活力测定：D-苏氨酸醛缩酶对底物对甲砜基苯甲醛的酶活力测定体系为：适量酶液、5mmol·L-1对甲砜基苯甲醛，50mmol·L-1甘氨酸，50μmol·L-1磷酸吡哆醛(PLP)，50μmol·L-1Mn2+于30℃振荡反应10min。反应结束后，取样进行液相检测。一个酶活力单位(Unit)的定义：每分钟催化对甲砜基苯甲醛产生1μmoll-syn-对甲砜基苯丝氨酸所需要的生物催化剂的量。用牛血清蛋白作为标准，用Bradford法测定蛋白浓度。实施例1：基于探针酶序列的基因挖掘技术筛选D-苏氨酸醛缩酶根据已报道的具有醛缩合成对甲砜基苯丝氨酸的D-苏氨酸醛缩酶(Alcaligenesxylosoxydans)的基因序列，利用此序列作为探针在NCBI数据库中进行检索并BLAST比对分析，找到与探针序列具有40％～70％同源性的候选酶基因，选取序列一致性较高的酶基因，并保证这些酶基因的来源菌株与探针不同种，进而根据检索到的基因序列设计引物，利用PCR扩增获得编码这些酶的DNA，并将它们进行克隆和表达，最后通过对目标底物(对甲砜基苯甲醛)进行活性和立体选择性的筛选，即获得高活性、高选择性的D-苏氨酸醛缩酶。实施例2：D-苏氨酸醛缩酶基因的克隆采用“一步克隆法”(同源重组)构建重组质粒pET28a-ApDTA。(1)首先使用营养肉汁琼脂培养基(蛋白胨10.0g,牛肉浸出物3.0g,NaCl5.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1.0L,pH7.0)，于25℃下活化复壮上述皮式无色小杆菌。然后待长出菌落后，将单菌落接入液体培养基中培养。离心获得菌体后，使用细菌基因组DNA试剂盒提取皮式无色小杆菌基因组DNA。(2)根据已报道的D-苏氨酸醛缩酶基因设计引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达D‑苏氨酸醛缩酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D‑苏氨酸醛缩酶。

【技术特征摘要】
1.一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达了氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-苏氨酸醛缩酶。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以是细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞为宿主细胞。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以大肠杆菌为宿主菌。4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌的表达载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌的表达载体为PET系列表达载体。6.一种权利要求1～5任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建重组质粒pET28a-ApDTA：将D-苏氨酸醛缩酶基因ApDTA与酶切过的质粒pET28a进行连接，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪晔，龚磊，许国超，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32